摘 要： 建立高效液相色谱法同时测定晕可平糖浆中5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸9种成分的含量。采用Phenomenex luna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流量为1 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长分别为245 nm（苯甲酸、甘草酸）、280 nm（5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛）和330 nm（咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸）。9种成分的质量浓度在各自范围内与对应的色谱峰面积线性关系良好，相关系数均为0.999 9，方法检出限为0.01～0.21 μg/mL，定量限为0.02～0.68 μg/mL。样品加标平均回收率为96.9%～105.0%，测定结果的相对标准偏差为1.3%～3.4%（n=6）。该方法简便可靠，重复性好，可用于晕可平糖浆的质量控制。

关键词： 晕可平糖浆； 指标成分； 高效液相色谱法

 

晕可平糖浆是由生赭石、夏枯草、法半夏、车前草4味中药组成的中药制剂，并加入矫味剂蔗糖、pH调节剂枸橼酸及抑菌剂苯甲酸钠，具有潜阳镇肝之功效，主治肝旺痰阻型的内耳眩晕症、头晕、目眩症。研究发现眩晕症多次发作后会影响大脑微循环，造成脑供血不足，而晕可平制剂能增强脑组织对缺血、缺氧的耐受力[1‒2]。处方中夏枯草含有酚酸类化合物丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸，这4种成分均具有抗脑缺血作用[3‒7]；法半夏的入血成分有原儿茶醛和甘草酸[8]，甘草酸对出血性、缺血性或缺血-再灌注性脑损伤以及化学品造成的神经损伤有显著保护作用[9]；车前草含有咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷[10‒11]，毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷互为同分异构体，在煎煮或弱酸性条件下毛蕊花糖苷可转化为异毛蕊花糖苷，两者药理活性相似，均具有抗氧化和神经保护作用[12‒14]。

此外，糖浆的辅料主要有蔗糖、枸橼酸和苯甲酸钠。在酸性条件下，蔗糖溶液长时间高温加热或低温贮藏会产生5-羟甲基糠醛，且枸橼酸和晕可平糖浆中的金属离子Ca2+、Mg2+能加快蔗糖形成5-羟甲基糠醛的速率[15‒18]。5-羟甲基糠醛具有抗心肌缺血、改善血液流变性等作用，但同时也存在致突变性和遗传毒性等毒副作用，且毒性具有浓度依赖性效应[19]。另一辅料苯甲酸钠的用量不足会增加微生物污染的风险，使用过量存在蓄积毒性、生殖毒性、神经毒性和致突变的作用[20]。

晕可平糖浆现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第二册，标准号为WS3-B-0372-90，该标准仅有性状和检查项，无含量测定项。笔者等[21]曾对晕可平糖浆中迷迭香酸单一成分进行了测定，但单一指标的评价模式难以反映中药制剂整体质量，多指标成分测定已成为全面评价制剂质量的可靠模式[22]，但目前尚未见同时测定晕可平糖浆中多种指标成分的方法。中药制剂中指标成分的测定方法主要有高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。上述两种方法均具有高效、灵敏、准确、稳定的特点，其中高效液相色谱法具有操作简便、检测成本相对较低的优势，应用范围更广，因此笔者建立高效液相色谱法同时测定晕可平糖浆中5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸和甘草酸9种成分，以期为该制剂质量控制及临床疗效评价提供技术支持。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent1260型，配二极管阵列检测器(DAD)，安捷伦科技(中国)有限公司。

电子天平：XS205型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

超纯水系统：Milli-Q Advantage A10型，默克化工技术(上海)有限公司。

超声波清洗器：B3200-T型，上海必能信超声有限公司。

5-羟甲基糠醛、丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸钠、毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸铵对照品：纯度(质量分数)分别为99.5%、97.8%、99.6%、99.7%、99.8%、95.2%、98.1%、96.2%，中国食品药品检定研究院。

异毛蕊花糖苷对照品：纯度(质量分数)为98%，成都克洛玛生物科技有限公司。

三氟乙酸、乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司。

甲醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

晕可平糖浆样品：共10批，批号分别为61200402、61200902、61201001、61201202、61210801、61220102、61220304、61220502、61220601、61221101，市售。

实验所用其他试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；流动相：A相为乙腈，B相为0.05%(体积分数，下同)三氟乙酸溶液，流量为1 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：25 ℃；检测器：二极管阵列检测器(DAD)；检测波长：苯甲酸、甘草酸为245 nm，5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛为280 nm，咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸为330 nm；进样体积：10 μL。

表1   梯度洗脱条件

Tab. 1   Conditions of mobile phase in gradient elution

 

1.3 溶液制备

对照品储备液：精密称取各对照品适量，用75%(体积分数，下同)甲醇溶液溶解并稀释，配制成5-羟甲基糠醛、丹参素(以丹参素钠质量的0.9倍计)、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸(由苯甲酸钠质量换算)、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸(由甘草酸铵质量换算)的质量浓度分别为1 354.20、2 262.99、1 744.00、1 138.57、16 578.82、1 060.53、981.96、4 228.11、730.90 μg/mL的对照品储备液。

混合对照品溶液：精密吸取适量各对照品储备液，置于同一只50 mL棕色容量瓶中，用75%甲醇溶液稀释至标线，配制成上述9种成分质量浓度分别为54.17、271.56、34.88、22.77、1 657.88、21.21、58.92、845.62、29.24 μg/mL的混合对照品溶液Ⅰ。另精密吸取适量各对照品储备液，置于同一只100 mL棕色容量瓶中，同法配制成上述9种成分质量浓度分别为2.71、108.62、14.82、10.82、795.78、14.85、53.03、105.70、6.58 μg/mL的混合对照品溶液Ⅱ。

系列混合对照品溶液：精密量取0.2、0.5、1、2.5、5、10 mL混合对照品溶液Ⅰ，分别置于6只10 mL棕色容量瓶中，用75%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，得系列混合对照品溶液，9种成分的质量浓度见表2。

表2   系列混合对照品溶液9种成分的质量浓度

Tab. 2   Mass concentrations of 9 components in a series of mixed reference solutions ( μg/mL )

 

样品溶液：精密量取晕可平糖浆样品5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加入75%甲醇溶液定容至标线，冰浴超声处理(功率为250 W，频率为33 kHz)5 min，用75%甲醇溶液定容至标线，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为样品溶液。

阴性样品溶液：按照处方比例和制备工艺，分别制备不含夏枯草、不含法半夏、不含车前草、不含蔗糖和防腐剂的阴性样品，并按样品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液。

1.4 实验方法

取混合对照品溶液Ⅰ和样品溶液，按1.2色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积，以外标法计算样品中各指标成分的含量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 流动相选择

分别考察乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%三氟乙酸溶液、甲醇-0.05%三氟乙酸溶液4种流动相体系。结果发现，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液为流动相时，色谱图基线平稳、色谱峰形尖锐、对称，各目标成分的分离度符合要求；以其他3种溶液为流动相时，丹参素和迷迭香酸与前后杂质峰的分离度小于1.5，因此选择乙腈-0.05%三氟乙酸溶液作为流动相。

2.2 检测波长选择

采用DAD检测器在200～400 nm波长范围内对各成分进行扫描，5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸和甘草酸的最大吸收波长分别为284、280、280、322、230、330、326、330、252 nm。结合杂质干扰和指标成分灵敏度选择检测波长，确定苯甲酸、甘草酸的检测波长为245 nm，5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛的检测波长为280 nm，咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸的检测波长为330 nm。

2.3 指标成分选择

根据《中华人民共和国药典》(2020年版)夏枯草、车前草的质量控制要求，选择糖浆中5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸和大车前苷10种成分进行测定。结果发现，糖浆中未检出大车前苷(检出限为0.02 μg/mL)。大车前苷属于苯乙醇苷类化合物，高温、高pH值、光照和金属离子会导致苯乙醇苷类成分降解[23]，故推测大车前苷在制剂过程中发生降解，故选择5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸和甘草酸9种指标成分。

2.4 提取方法选择

分别考察冰浴超声和加热回流两种提取方式。结果发现，采用加热回流提取样品时，5-羟甲基糠醛的含量较高，与温度升高可促进5-羟甲基糠醛生成的文献报道一致[20]，故选择冰浴超声提取法。

分别考察水、60%甲醇溶液、70%甲醇溶液、75%甲醇溶液、85%甲醇溶液、甲醇、75%乙醇溶液、乙醇8种溶剂的冰浴超声提取效果。结果表明，以75%甲醇溶液为溶剂时，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的测定结果最大，各成分色谱峰形较好且杂质干扰小，故选择75%甲醇溶液作为溶剂。

以75%甲醇溶液为溶剂，分别考察超声时间为0、5、10、15、30 min时的提取效果[24‒26]。结果表明，各成分的提取效果无显著差异，为确保各成分充分溶解并节省实验时间，选择提取时间为5 min。

2.5 专属性试验

取混合对照品溶液Ⅰ、样品溶液、阴性样品溶液各10 μL，在1.2色谱条件下进样测定，可以看出，各成分色谱峰与相邻色谱峰分离度良好，样品基质无干扰，表明该方法专属性良好。

 

2.6 线性方程、检出限和定量限

按1.2色谱条件分别测定系列混合对照品溶液，以质量浓度为横坐标(x)，以色谱峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将混合对照品溶液用75%甲醇溶液逐级稀释，按1.2色谱条件进样测定，以信噪比为3时的质量浓度为检出限，以信噪比为10时的质量浓度为定量限。9种成分的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表3。由表3可知，各成分在各自质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好。

表3   9种成分的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 3   Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit of 9 components

 

2.7 稳定性试验

按1.3方法制备样品溶液(批号为61200902)，分别于第0、3、6、12、18、24 h时进样测定，结果见表4。由表4可知，5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸色谱峰面积测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为1.0%、0.5%、1.4%、0.6%、0.6%、1.6%、0.8%、0.8%、1.2%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

表4   稳定性试验结果

Tab. 4   Results of stability test

 

2.8 样品加标回收与精密度试验

取各成分含量已知的样品(批号为61200902)　6份，每份2.5 mL，精密加入10 mL混合对照品溶液Ⅱ，按1.3方法制备加标样品溶液，在1.2色谱条件下进样测定，计算回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表5。由表5可知，5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸的加标平均回收率分别为98.7%、105.0%、99.4%、100.1%、99.6%、103.9%、96.9%、101.2%、98.2%，测定结果的相对标准偏差分别为3.0%、1.6%、2.1%、2.0%、1.3%、2.5%、2.9%、3.1%、3.4%，表明该方法准确度和精密度较高。

表5   加标回收与精密度试验结果

Tab. 5   Results of spiked recovery and precision test

 

3、 结语

 

建立了高效液相色谱法同时测定晕可平糖浆中5-羟甲基糠醛、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸9种成分的含量。该方法简便可靠，重复性好，可用于晕可平糖浆的质量控制，进而为其质量标准提高提供参考。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 晕可平糖浆