摘  要

 

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）产品属于“活体药物”，其作用机制和体内行为与传统药物存在明显不同。本文基于国内已上市的CAR-T产品阐述了CAR-T产品的细胞动力学特点，以及获得此类产品的细胞动力学数据的生物分析方法，并进一步基于作用机制及相关文献调研情况分析了CAR-T产品的细胞动力学过程的影响因素。对此类产品细胞动力学特征的深入分析，可为后续同类产品体内过程研究和基于暴露-效应关系开展剂量探索工作奠定基础。

 

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是通过基因工程技术对T细胞进行改造，使T细胞表达能够识别特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体，当被抗原识别和结合后，产生刺激信号传至胞内信号域，T细胞被激活并发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。随着技术的发展，近年来CAR-T产品在治疗恶性肿瘤和某些自身免疫性疾病方面展现出了巨大的潜力，但同时也面临着因细胞因子大量释放带来的药物不良反应和/或毒性反应以及生产成本过高等挑战。如能基于具体CAR-T产品特点及人体病生理相关信息来预测其在体内的细胞动力学特征，进一步结合生物标志物、肿瘤负荷等受试者的基线状态情况，可能有助于帮助评估产品的预期疗效和毒性反应。

 

与传统小分子化学药物或者治疗性蛋白药物不同，CAR-T产品是“活”的药物，输注的特定阳性细胞数量与输注后的反应或体内扩增能力没有相关性，然而，其在体内的活力及扩增情况与细胞治疗产品的安全有效性密切相关，产品自身及某些生产因素、肿瘤或疾病负荷、患者的免疫系统状态等因素可能会对此类产品的体内过程产生影响，这也给早期临床研究中给药方案的制定带来了挑战。本文主要介绍CAR-T产品的体内过程及生物样本分析内容，进一步分析影响此类产品体内过程的因素，以期为给药方案制定及后续开发提供思路。

 

1、 CAR-T产品的细胞动力学过程

 

细胞治疗产品的“活的”特性导致其进入体内后的过程与传统化学小分子和治疗性蛋白药物不同，通常不经历典型的吸收、分布、代谢和排泄过程。CAR-T细胞进入体内后一般经历分布、增殖（有的细胞发现存在分化的现象）、耗竭等过程。不同产品因具体作用机制的差异，在体内存续时间跨度可从几天至数年。通过体外基因转导生产的CAR-T细胞进入体内后在杀伤靶细胞的同时可不断地进行扩增，被誉为“CAR-T细胞疗法之父”的Carl June教授在2010年将CAR-T细胞推进到人体临床试验，在一项研究中2例获得完全缓解的慢性淋巴细胞白血病患者在10年后仍可在外周血中定量检测到CAR-T细胞，且未发现白血病复发迹象。对于通过具有靶向性的LNP递送mRNA在体内生成CAR-T细胞的产品，由于mRNA并未整合到T细胞基因组中，故其在体内的存续时间可能仅有几天时间，不能持续扩增，这种基于mRNA的CAR-T疗法是一种短期疗法，有研究团队在探索此类产品用于重症肌无力等的治疗。

 

CAR-T类产品通常可以采用细胞浓度-时间曲线来表征其进入体内后的细胞动力学行为。一定数量的第二代抗CD19的CAR-T细胞进入体内后首先分布至各组织，血液中的CAR-T细胞水平最初呈现短暂的下降（Tlag），细胞水平甚至可能降至低于定量下限，随后CAR-T细胞开始扩增。反映在细胞动力学曲线上时，可包括分布、扩增、衰减和持续4个时相，部分细胞治疗产品可能因体内行为不同仅包含部分时相。

 

研究CAR-T产品的体内过程时，可通过适宜的细胞动力学参数来表征细胞在体内各阶段的特征。目前已批准的CAR-T类产品常用的细胞动力学参数有Cmax、Tmax、AUC、Cmax/Tmax、Tlast、Clast等。Cmax是CAR-T细胞扩增的最高浓度水平，Tmax是达到最高浓度水平的时间，因此细胞动力学参数Cmax/Tmax可用来表征细胞在体内的扩增速率，Clast和Tlast可用于表征细胞在体内存续的水平及时长。美国食品药品监督管理局( FDA)推荐关注以下与CAR-T细胞扩增和持久性相关的细胞动力学参数：Cmax、Tmax、pAUC、Clast、Tlast、t1/2。AUC或pAUC可用来反映一段时间内CAR-T细胞在体内的暴露水平。传统药代动力学研究中的半衰期t1/2用于反映机体对药物的清除速率，对于CAR-T产品来说，在细胞与机体的相互作用下，根据细胞动力学曲线计算得到的t1/2很大程度上依赖于采样或随访时间设置，且存在较多的变异或影响因素，CARVYKTI的一项临床研究中发现3例受试者在第1个CAR-T峰值后出现了重新扩增，如根据细胞动力学曲线计算t1/2，该数据结果可提供的价值有限，应谨慎解读相关结果。药物的临床开发过程中可选择合适的细胞动力学参数如Cmax/Tmax、AUC（如AUC0-28 d，AUC0-96 d）等用于暴露-疗效和/或暴露-安全性的分析。

 

为可靠地描述CAR-T细胞在体内的动力学特征，细胞动力学样本的采样计划要有足够多的时间点，尤其是在扩增阶段应该考虑设计相对密集的采样计划。由于细胞治疗产品在体内的存活及增殖/扩增过程复杂，其暴露水平在患者间的变异与化学小分子药物或传统生物制剂相比会更大。进行细胞动力学评价时应根据具体情况选择适宜的细胞动力学参数，并根据产品特点和作用机制对相关参数进行合理解读。

 

2、 细胞动力学样品检测

 

获得可靠的血药浓度数据是细胞动力学评价的基础和前提，应根据具体产品采用适宜的检测手段对细胞动力学样品进行分析。如果一种方法不能完全反映细胞在体内的细胞动力学特性，可采用多种方法监测细胞在体内的增殖和存活情况，通过对特定基因拷贝数和特定阳性细胞数量进行细胞动力学样本的检测，有助于互相验证检测方法的可靠性，可更全面地分析产品在体内的扩增和存活情况。可采用的方法有基于分子检测的实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）或数字聚合酶链反应（dPCR)和基于表型检测的流式细胞术等，此外，荧光和放射性标记成像也可用于监测CAR-T的细胞动力学。

 

流式细胞术检测通常报告转基因表达细胞的结果，以所测量的总细胞中特定阳性细胞的百分比表示。对于基于qPCR的评估，通常是以每微克(μg)DNA的拷贝数表示，此外PCR检测结果也可以表示为每毫升（mL）的拷贝数。为了比较从表型和分子测量中获得的结果，可以基于体积应用转换因子。为解决自体CAR-T细胞开发时生产成本高以及耗时长的挑战，通用型CAR-T也逐渐受到较多的关注。通用型CAR-T产品开发的方法之一是通过基因编辑技术重新设计供者αβT细胞，使其与受者相容避免发生移植免疫排斥反应。另一种方法是利用先天免疫细胞（如自然杀伤细胞和γδT细胞）来开发CAR-T产品。用于通用型CAR-T产品的细胞动力学考察的生物分析计划需针对所使用的特定免疫细胞亚群来开发。

 

流式细胞术用荧光试剂（通常是单克隆抗体）标记细胞悬液，通过每个细胞的荧光特征进行细胞分群以确定CAR-T细胞的数量。用于检测细胞表面CAR表达的试剂主要包括针对CAR的单链可变区片段（scFV）结构域、免疫球蛋白结合蛋白（蛋白L）或目标抗原本身等多种特异性单克隆抗体。由于CAR-T细胞的水平通常低于患者的总细胞数量，用于鉴定目标细胞的试剂的特异性和选择性因而非常重要。用流式细胞术考察细胞动力学的另一个特点是其检测限通常高于qPCR、dPCR等PCR方法。采用流式细胞术检测不到目标细胞时可能并不代表细胞中目标蛋白未表达，而可能是该方法检测灵敏度低导致。因此，有可能在基于PCR的基因扩增试验中检测到转导基因，但流式细胞术没有检测到相关细胞。虽然流式细胞术存在灵敏度低的局限性，但由于它能提供活的/有功能的CAR-T细胞的数量的结果也有一定的潜在优势，并且流式细胞术的表型测量通常也可用于对细胞亚群中免疫表型和CD4+/CD8+细胞比率等项目进行表型表征。

 

由于更高的灵敏度、易于采样、可重复性、取样量少等优点，基于PCR的方法也被广泛用于监测CAR-T产品的细胞动力学。与流式细胞术的方法相比，qPCR的方法因耗时较长限制了实时分析的可能，并由于选择性较低，使其不能区分表达CAR的细胞和含有CAR转基因拷贝但不能表达受体的T细胞。基于PCR的方法中，dPCR可提供更高的灵敏度，无需标准曲线可对目标DNA进行绝对定量，通过把模板分散到各个反应微单元降低了抑制药对扩增的影响，但由于需要根据不同的模板序列合成不同的探针成本也相对较高。在确定是否使用qPCR或dPCR检测细胞动力学样本时，应考虑检测所需的灵敏度和动态范围，通常qPCR较dPCR可提供更宽的动态范围，在研究过程中检测平台应保持一致。

 

3、 国内已上市CAR-T产品的细胞动力学特征

 

目前国内已上市6款CAR-T产品，其中阿基奥仑赛注射液、瑞基奥仑赛注射液、纳基奥仑赛注射液和泽沃基奥仑赛注射液的靶点为CD19，伊基奥仑赛注射液和西达基奥仑赛注射液的靶点为B细胞成熟抗原（BCMA）。这些产品经静脉输注给药后约在7~14 d在体内达到最大暴露水平，其中瑞基奥仑赛的说明书显示在不同适应证患者中达到最大暴露水平的时间略有差异。国内批准上市的CAR-T产品的说明书显示，经静脉输入体内后，CAR-T细胞可在体内长期存在。截至最初上市批准时，西达基奥仑赛在体内的存续时间可达25.3个月。阿基奥仑赛、伊基奥仑赛和泽沃基奥仑赛明确在相关适应证中获得缓解的患者体内抗CAR-T细胞Cmax和AUC的中位水平较未缓解者会更高。瑞基奥仑赛在成人复发/难治性大B细胞淋巴瘤和成人复发/难治性滤泡性淋巴瘤患者血液中CAR-T细胞的数量与3个月客观缓解（完全缓解或部分缓解）未见显著相关性，在成人复发/难治性套细胞淋巴瘤获得客观缓解的患者体内CAR-T细胞的Cmax和AUC1-29高于未获得客观缓解的患者，瑞基奥仑赛的观察结果可能与样本量有关，但也在一定程度上提示，同一产品在不同病理组织学特征状态下的细胞动力学可能存在差异。这在HAMILTON等的研究中也有证明，在接受TECARTUS治疗套细胞淋巴瘤的患者中，CD19 CAR-T扩增和持续性较治疗大B细胞淋巴瘤更高，提示该产品在体内的扩增具有疾病组织学依赖性。纳基奥仑赛外周血中CAR-T细胞的Cmax和AUC0-28 d与最佳疗效（是否达到完全缓解或完全缓解伴不完全血液学恢复）未见显著相关性。

 

在CAR-T治疗时，发生细胞因子释放综合征（CRS）或免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）后可能会根据严重程度用到托珠单抗和/或皮质类固醇来治疗。所有产品均显示，用到皮质类固醇患者的暴露水平（Cmax和/或AUC）高于未使用皮质类固醇的患者。除西达基奥仑赛外，其他5个产品的说明书显示，使用托珠单抗的患者的暴露水平高于未使用的患者。FDA公布的相关产品的审评报告显示，类固醇及托珠单抗的使用是临床药理关注的重点。回顾性分析表明，早期使用托珠单抗并不影响CAR-T细胞的Cmax、AUC0-28 d、持久性或完全缓解率。皮质类固醇也不会导致CAR-T细胞Cmax、AUC0-28 d或临床缓解率的显著降低。但由于皮质类固醇通常仅在严重的托珠单抗难治性CRS或ICANS患者中使用，而这些患者中通常已经发生快速的CAR-T细胞扩增。因此，不能排除皮质类固醇对早期CAR-T细胞扩增或对抗肿瘤反应的持久性产生影响。

 

由于CAR-T细胞的增殖水平高度依赖于靶抗原，CAR-T细胞通过“CAR”精准识别并结合肿瘤细胞表面的特异性抗原（如CD19、BCMA等），从而激活CAR-T细胞，达到杀伤靶细胞和扩增CAR-T细胞的目的。靶抗原的持续存在是CAR-T细胞得以持续扩增并充分发挥抗肿瘤作用的关键要素。国内部分已上市产品的说明书中也针对肿瘤负荷对细胞动力学的影响做了相关说明，其中纳基奥仑赛基线期肿瘤负荷>50%患者外周血中CAR-T细胞的Cmax中位值和AUC0-28 d中位值均高于肿瘤负荷≤50%患者的相应参数，分别为1.31倍和2.39倍。但伊基奥仑赛基线期肿瘤负荷和桥接治疗对本品的Cmax和AUC无显著影响。虽然肿瘤负荷相对较高的人群中倾向于CAR-T细胞的扩增，但由于高肿瘤负荷本身可能是预后不良的一个重要因素，因此这类患者中细胞扩增水平或细胞暴露水平并不一定与患者预后存在正相关性。高肿瘤负荷的患者中既需要维持CAR-T细胞的扩增，但为了避免大量扩增带来的毒性风险，也需要尽量控制细胞的扩增速度，即CAR-T细胞以适宜的扩增速度来平衡疾病控制和细胞因子释放带来的毒性。

 

除了合并使用药物（如托珠单抗、皮质类固醇）和肿瘤负荷会影响CAR-T产品的细胞动力学外，免疫原性、患者的免疫状态、清淋预处理等多种因素都有可能影响此类产品在体内的扩增情况，但可能会因细胞动力学参数的高度变异性而难以通过群体药代动力学的方法筛选出单一影响因素。对于特定的细胞动力学数据可能是多种因素的综合作用结果。综合以上暴露-效应关系以及相关因素对细胞动力学的影响情况，适宜的体内暴露水平是CAR-T产品治疗疾病过程中平衡毒性和疗效的关键，在探索适宜的暴露水平时需同时考虑产品特点、患者自身疾病状态以及治疗干预等多种因素综合考虑。

 

4、 讨  论

 

目前国内外已获批上市的CAR-T产品的暴露-效应关系分析显示，响应者的体内CAR-T暴露水平要高于未响应者。同时发生高级别CRS事件的受试者的暴露水平也高于发生低级别CRS事件的受试者。因此CAR-T产品在体内的暴露情况既影响疗效也与毒性相关，而CAR-T的细胞动力学具有高度变异性，因此考察CAR-T细胞的细胞动力学特点，明确识别各项影响细胞动力学的内在和外在因素，对制定平衡疗效和毒性的给药方案有重要意义。

 

由于CAR-T产品进入体内后通过复杂生物信号通路调控发挥治疗作用并可以继续增殖，导致此类产品的体内过程不适合以传统药代动力学（即机体对药物的处置）的思路来考虑。但借鉴传统药代动力学的方法，可以通过细胞浓度-时间曲线的形式来表征细胞进入体内后的动力学变化过程来对其进行研究，细胞动力学曲线反映的是CAR-T细胞与机体相互作用的结果，因此CAR-T产品的体内过程必将受到来自生理状况、治疗干预、产品自身特点等因素的影响。由于产品及体内过程的复杂性，上文中关于细胞动力学影响因素的分析可能也不全面，还需要更多的研究证据进一步完善。

 

随着技术的发展，通用型CAR-T、体内生成CAR-T等多样化的CAR-T产品已进入临床开发阶段。在影响因素混杂的情况下，可能难以通过经验的方法来判断产品进入体内后的变化趋势，基于机制的定量药理学方法或许能帮助理解和预测CAR-T产品在体内的动力学过程。有研究人员用定量系统药理学（QSP）方法定量分析了靶向CD-19的CAR-T产品剂量、疾病负荷和促炎细胞因子之间的复杂关系，对临床疗效和安全性影响因素的分析显示，CAR-T的扩增和B细胞的消除与疾病负荷的相关性比CAR-T产品的给药剂量更高，该结论与相关研究中观察到的情况相似。QSP模型的应用在一定程度上可帮助更好地理解CAR-T产品的作用机制与临床结局之间的联系，从而指导CAR-T产品的开发和剂量优化。

 

 

 

来源：CJCP临床药理学

关键词： 嵌合抗原受体T细胞