摘 要： 建立了一种快速分析筛查农作物中五氯酚及其钠盐残留的硫酸磺化-同位素内标稀释-超高效液相色谱-串联质谱法。通过调节样品pH值将样品中五氯酚钠转化成五氯酚后用正己烷提取，再进行磺化处理，采用超高效液相色谱串联质谱法进行测定，内标法定量。结果表明，五氯酚的质量浓度在0.15~10 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数大于0.999，方法检出限为0.15 μg/kg，定量限为0.50 μg/kg。样品的平均加标回收率为87%~108%，测定结果的相对标准偏差为2.11%~12.08%（n=6）。该方法操作简便且净化效果好，可用于食品安全风险监测中大批量样品快速分析筛查。

关键词： 农作物； 五氯酚及其钠盐； 磺化； 超高效液相色谱-串联质谱法； 内标法

 

20世纪30年代起五氯酚(PCP)及其钠盐五氯酚钠(PCP-Na)因其高效、廉价的特性，作为除草剂、防腐剂和杀虫剂被广泛应用于农业[1]。然而，PCP的化学性质稳定，在自然环境中不易降解，容易在土壤和水体中残留，并被植物吸收，最终通过食物链影响动植物及人体健康[1-2]。由于其广泛使用，多地水质、土壤、动植物等重要生物链环节遭受污染[3]，影响人类健康[4-6]。国际癌症研究机构和美国环境保护局已将PCP及其钠盐列为2B类致癌物和持久性有机污染物[7-9]，东南亚、欧盟地区已将其列为禁用物质，我国农业农村部公告第250号《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》也禁止其在动物源性食品中使用。

目前植物源性食品中PCP及其钠盐尚无相关检测标准和限量标准，且现有PCP的测定方法中多数需要使用到固相萃取柱等净化材料，有的还需要对PCP进行衍生化处理[10-12]，过程较为复杂且实验成本较高。笔者建立了一种快速分析筛查农作物中PCP及其钠盐残留的硫酸磺化-同位素内标稀释-超高效液相色谱-串联质谱法，为植物源性食品中PCP及其钠盐检测技术的研究开发提供参考数据和理论依据，并为制定相关检测和限量标准提供详细思路和可靠依据。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用仪：Xevo TQ-S型，美国沃特世公司。

涡旋混合器：MS 3basic型，德国艾卡公司。

超声波振荡器：S900H型，德国艾尔玛公司。

氮吹浓缩仪：TURBOVAP型，美国拜泰齐公司。

电子天平：MS204S型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

超纯水机：Milli-Q型，美国密理博公司。

微孔滤膜：130 mm×0.22 µm，北京纳鸥科技有限公司。

甲醇、正己烷：均为色谱纯，德国安谱实验科技股份有限公司。

硫酸：优级纯，广东广试试剂科技有限公司。

PCP-Na溶液标准物质：质量浓度为1 000 µg/mL，标准物质编号为91412b，坛墨质检科技股份有限公司。

五氯酚同位素内标(13C6-PCP)：质量浓度为100 µg/mL，标准物质编号为94016a，坛墨质检科技股份有限公司。

农作物样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Waters XSelect®HSS T3 柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm，美国沃特世科技有限公司)；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A相为5 mmol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇溶液，流量为0.35 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   gradient elution program

 

1.2.2 质谱仪

离子源模式：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测模式；脱溶剂温度：500 ℃；离子源温度 ：150 ℃；锥孔气：氮气，流量为2 500 mL/min；脱溶剂气：氮气，流量为16 670 mL/min；毛细管电压：3.00 kV；五氯酚及其内标物的保留时间、锥孔电压、碰撞能量、定性及定量离子对定见表2。

表2   PCP及其内标物的保留时间、锥孔电压、碰撞能量、定性及定量离子对

Tab. 2   Retention time, cone-hole voltage, collision energy, qualitative and quantitative ion pairs of pentachlorophenol and its internal standard

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制

PCP-Na储备液：取100 µL PCP-Na溶液标准物质至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，得到质量浓度为10 µg/mL的PCP-Na储备液，于-18 ℃避光保存。

13C6-PCP储备液：准确量取1 mL 13C6-PCP于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，得到质量浓度为10 µg/mL的13C6-PCP储备液，于-18 ℃避光保存。

PCP系列标准工作溶液：以40%甲醇水为稀释剂，精密量取上述两种储备液适量，配制成相当于PCP质量浓度分别为0.15、0.5、1、2、5、10 ng/mL的PCP系列标准工作溶液(13C6-PCP同位素内标质量浓度均为1 ng/mL)。

1.3.2 样品处理

精密称取5 g(精确到0.01 g)农作物样品于50 mL离心管中，加入适量的13C6-PCP溶液，再加入2 mL浓硫酸，混匀(谷物类、茶叶等含水量较低的样品需先加入5～10 mL超纯水将其完全浸润)，加入10 mL正己烷涡旋提取3 min后再超声提取5 min，以9 000 r/min于4 ℃下离心3 min，吸取2 mL上清液，置于10 mL试管中备用。向2 mL上清液中加入1 mL浓硫酸后低速涡旋10 s进行磺化，以3 000 r/min于4℃下离心5 min，取1 mL上清液于40 ℃氮吹至近干，加入0.5 mL乙腈溶液复溶，经0.22 µm微孔滤膜过滤至样品瓶中待测定。

1.3.3 样品测定

按照1.3.２对样品进行制备及处理，采用高效液相色谱-质谱联用法进行测定，以内标法定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 实验条件优化

2.1.1 色谱条件选择

PCP疏水性较强，大部分研究使用C18色谱柱进行检测[13-14]。由于不同品牌C18色谱柱填料中硅胶纯度不同，键合杂化技术等生产工艺存在差异，会影响目标化合物在质谱中的灵敏度。对比了Waters、Agilent、Thermo多个品牌不同型号的C18色谱柱，结果表明，PCP在多款色谱柱中均存在一定程度的色谱峰宽过大或拖尾现象，Waters XSelect®HSS T3 色谱柱的分离效果最佳，峰形较为理想，最终选定其作为分析柱。此外，在流动相中加入缓冲盐可提高目标化合物在质谱中的离子化效率，有效增强其质谱响应，因此选用甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相。

2.1.2 质谱条件选择

PCP为化学性质稳定的化合物，其分子结构为共轭结构，离子在碰撞室中较难被打碎,不易获得特征离子[15]。PCP分子结构中含5个Cl原子,Cl元素有35Cl和37Cl两种同位素，在ESI-模式下将500 ng/mL PCP甲醇溶液以5 mL/min的流量注入质谱仪进行母离子全扫描，得到质荷比（m/z）262.7，262.7、264.7，264.7、266.7，266.7、268.7，268.7。通过优化毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量对选定的母离子进一步打碎，得到PCP离子对为m/z 264.7，35.0、266.7，35.0，13C6-PCP离子对为m/z 270.7，35.0、272.7，35.0。PCP、13C6-PCP典型多反应监测谱图如图1所示，未进行打碎的4个母离子组成的离子对在谱图上表现出较高的基线，且除了m/z 262.7，262.7外13C6-PCP在其余三个离子对的相同保留时间上均存在干扰信号，因此选取PCP定量离子对为m/z 264.7，35.0，定性离子对为m/z 266.7，35.0；13C6-PCP定量离子对为m/z 270.7，35.0。

图1   PCP、13C6-PCP典型多反应监测谱图

Fig. 1   Typical multi reaction monitoring spectra of PCP and 13C6-PCP

2.1.3 提取溶剂选择

PCP易溶于有机溶剂而PCP-Na易溶于水[16]，在酸性条件下，PCP及其钠盐以PCP形式存在，在碱性条件下则转换成PCP-Na。由于乙腈在提取过程中相较于甲醇更为简单，分别选择乙腈-水(1∶1，体积比，下同)、含3%三乙胺的乙腈-水(1∶1)、含1%甲酸的乙腈-水(4∶1)、含10%硫酸的正己烷、含20%硫酸的正己烷为提取溶剂，考察不同溶剂对样品中PCP-Na的提取效果。结果表明，含3%三乙胺的乙腈-水(1∶1)、含1%甲酸的乙腈-水(4∶1)与含10%硫酸的正己烷提取效果相近，较乙腈-水(1∶1)提取效果好，含20%硫酸的正己烷是所有提取溶剂中提取效果最好的。因农作物中含有大量水分，以上溶剂中只有正己烷不溶于水，考虑到后续净化条件，最终选择含20%硫酸的正己烷作为提取溶剂。

2.1.4 提取方式选择

首先比较不同提取溶剂体积及不同提取次数对回收率的影响。结果表明，当相同条件下提取体积为5、10、20 mL时，样品回收率相差不大，最终选择提取溶剂体积为10 mL。比较采用10 mL提取溶剂提取一次和采用10 mL提取溶剂分两次进行提取(1次5 mL)的样品回收率，结果表明，两种提取方式回收率相差不大。此外，比较涡旋、震荡、超声３种常见提取方式的回收率，结果表明，涡旋的提取效率最高，其次是震荡提取，超声提取的效率最低。进一步比较后发现，先涡旋再进行震荡提取，能有效提高不同基质中五氯酚及其钠盐的回收率。综合考虑提取效率和实验成本，最终选择提取方式为使用10 mL提取溶剂涡旋提取一次后再进行超声提取。

2.1.5 净化条件选择

在农药检测中基质干扰是影响检测灵敏度的一个重要因素，目前常见的净化方法有液-液分配法[17]、QuEChERS法[18]、固相萃取净化法[19]、浓硫酸磺化法[20]。液-液分配法操作简单但对色素及纤维含量较高的植物源性食品净化效果较差；QuEChERS法分别尝试了３种净化方案，结果表明个别样品基质中五氯酚及其钠盐回收率偏低；固相萃取净化效果较好，但操作过程较为繁琐且实验成本较高；浓硫酸磺化法净化效果好且操作简单，能有效提高检测效率，降低实验成本，适合用于性质稳定的农药检测，因此最终选择浓硫酸对样品进行净化处理，净化效果如图2所示。此外，还比较了不同品牌的微孔滤膜对PCP、PCP-Na的吸附情况，结果显示个别品牌的微孔滤膜对PCP、PCP-Na有较强的吸附，会导致回收率和实验结果的准确度降低。

图2   多种样品基质净化效果

Fig. 2   Purification effects of various sample substrates

2.2 线性方程及检出限

取PCP系列标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下，以PCP定量离子对峰面积与其同位素内标峰面积的比值(y)为纵坐标，PCP质量浓度(x)为横坐标绘制6个浓度水平的工作曲线，线性方程为y=0.511x+0.038。五氯酚的质量浓度在0.15~10 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 4。向不同空白基质中加入PCP标准溶液进行逐级稀释，以3倍信噪比响应值对应的质量浓度0.15 ng/mL计算检出限，10倍信噪比响应值对应的质量浓度0.5 ng/mL计算定量限，按取样量5 g计算，得该方法检出限为0.15 µg/kg，定量限为0.50 µg/kg。

2.3 基质效应

在质谱分析中基质效应是影响检测灵敏度、准确度的重要因素[21]，基质效应(ME)按式(1)计算：

 

基质效应=×100% (1)

ME为正值表示存在基质增强效应，负值表示存在基质抑制效应，以绝对值作为判断依据，绝对值越大则表示该样品基质效应越强[22]。|ME|小于20%表示弱基质效应；|ME|介于20%～50%之间表示中等强度基质效应；|ME|大于50%表示强基质效应[23]。不同农作物的基质效应见表3，由表3可知，多种农作物均存在中等强度基质效应且个别样品存在强基质效应。采用浓硫酸对样品基质进行净化处理，并采用同位素内标13C-PCP对基质效应进行校正，能有效降低基质效应的影响，从而提高检测结果的准确性和稳定性。

表3   不同农作物的基质效应

Tab. 3   Matrix effects in different crops

2.4 加标回收及精密度试验

分别向5 g不同基质的空白样品中加入0.5、1.0、5.0 µg/kg 3个浓度水平的PCP-Na，每个加标水平测定6次，加标回收及精密度试验结果见表4。由表4可知，平均回收率为87%～108%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为2.11%～12.08%，表明该方法的准确度和精密度良好，符合检测要求。

表4   加标回收及精密度试验结果

Tab. 4   Results of spiked recoveries and precision test

2.5 稳定性试验

对不含PCP-Na的农作物样品进行加标质量浓度为0.5 µg/kg的稳定性试验，在1.2仪器工作条件下，分别在第0、2、4、8、12、24 h对待测溶液进行检测分析。稳定性试验结果见表5，由表5可知，样品中PCP在24 h内的质量浓度无明显变化，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

表5   稳定性试验结果

Tab. 5   Results of stability test

 

3. 结语

 

建立了一种农作物中痕量PCP及其钠盐的快速分析筛查方法，该方法操作简便且净化效果好，具有较高的准确度和灵敏度，方法检出限、定量限均达到痕量分析标准，适用于农作物及植物源性食品中PCP及其钠盐的定性、定量分析，可用于食品安全风险监测中大批量样品快速分析筛查。

 

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引用本文： 黄圣南，陈贻钢，王显龙，等 . 硫酸磺化-同位素内标稀释-超高效液相色谱-串联质谱法快速筛查农作物中五氯酚及其钠盐残留［J］. 化学分析计量，2024，33（11）：13. (HUANG Shengnan, CHEN Yigang, WANG Xianlong, et al. Rapid determination of pentachlorophenol and its sodium salt residues in crops by sulfuric acid sulfonation-isotope internal standard dilution-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 13.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 农作物 五氯酚