《中华人民共和国药典》（2020 年版）（简称“《中国药典》”）收载了9251 细菌内毒素检查法应用指导原则。同年，《美国药典》（47 版）（简称“《美国药典》”）也收载了1085 细菌内毒素检查法应用指导原则。表明细菌内毒素检查法在世界范围内经过多年发展，为了应对新的情况，均需要进行新的官方解读和指导。中、美两国药典中的内毒素检查法指导原则具有多项不同，本文参考《美国药典》1085 细菌内毒素检查法应用指导原则和《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则，对中美内毒素标准物质管理、质量管理的异同，指导原则中易误读的要点解读等相关内容进行概括，为内毒素检测从业者提供参考。

 

 

 

凝胶法（Gel-clot technique）SOP示例

1 适用范围

依据USP <85>, Ph. Eur. 2.6.14, Ch.P<1143> 和JP XVII Chapter 4.01制定的细菌内毒素的检测方法。该方法可支持产品开发的各个阶段。

2 样品要求

每种样品至少准备 1 瓶。

1)常规批次放行检测时，分别对每批起始、中间和末尾的 1 瓶样品进行单独检测。

2)稳定性检测时，每个稳定性时间点检测 1 瓶样品，不得混合多个样品瓶。

3 安全注意事项

始终遵循安全的实验室操作规范。若不熟悉特定化学品的安全预防措施，处理前需查阅相应的安全数据表（SDS）。

4 仪器与设备

1)微孔板（96 孔）

2)去热原或无热原稀释管

3)用于对玻璃器皿进行去热原处理的热空气烘箱或马弗炉（250°C）

4)无热原血清移液管

5)无热原艾本德移液器及吸头

6)涡旋混合器

7)石蜡膜

8)校准定时器

9)酶标仪（Bio - Tek® 型号 ELx - 808，BioTek 仪器公司生产）

10)内毒素分析软件，Endoscan V

5 溶剂 / 试剂 / 化学品

1)控制标准内毒素（CSE）

2)Endochrome - K 裂解物试剂（Charles River 公司生产）

3)LAL 试剂水（LRW）

6 溶液制备

注：EU（内毒素单位）和 IU（国际单位）为等效单位。

6.1 LAL 试剂水（LRW）

使用经认证的 LRW 稀释标准品，并制备阳性对照。

A.标准曲线制备

1)按照标准内毒素的复溶和储存说明进行操作。CSE 的效价与其配套的裂解物相关。根据供应商的分析证书，确认特定 CSE - 裂解物组合的正确复溶体积。

2)查阅 CSE 产品说明书，获取稳定性信息和产品限制条件。

3)按厂家说明复溶标准品，涡旋 5 分钟。用无热原水制备标准曲线稀释液，操作如下（每次稀释前涡旋 1 分钟，再进行后续稀释）：

复溶后的内毒素 = 50 EU/mL

0.5 mL（50 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 5.0 EU/mL

0.5 mL（5 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.5 EU/mL

0.5 mL（0.5 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.05 EU/mL

0.5 mL（0.05 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.005 EU/mL

每个标准溶液（5.0 - 0.005 EU/mL）均需在两个孔中进行检测。

B.样品制备说明

1)用 1 mL LRW 复溶样品（5 mg/mL）。

2)1:50 稀释：取 0.1 mL 样品加入去热原容器，再加入 4.9 mL LRW，充分涡旋混匀。最终稀释液在两个孔中进行检测。将数据输入Endoscan - V 软件时，孔位布局读数为0.1000，结果以 EU/mg 表示。

C.对照设置

1)阳性产品对照（PPC）：为每个样品制备 PPC，直接在检测板上向 100 µL 样品中加入 10 µL 浓度为 5.0 EU/mL 的标准品（由 CSE 制备），加入的内毒素常称为 “加标”。检测板上的名义浓度为 0.5 EU/mL。

2)阴性对照（NC）：使用 LRW 作为阴性对照（见下文 7 检测步骤部分），阴性对照需在两个孔中进行检测。

6.2（Endochrome K）裂解物试剂

小心取下小瓶瓶塞，向冻干的裂解物小瓶中加入 3.2 mL LRW。重新塞上瓶塞，轻轻颠倒混匀数次，请勿涡旋。若样品数量足够，需要使用多个小瓶时，将各小瓶内容物混合。复溶后的裂解物可在 2 - 8°C 储存，最长不超过 24 小时。

7 检测步骤

1)根据需要准备检测仪器。对于酶标仪，需输入样品描述信息、设置检测参数，并开启设定为 37 ± 1°C 的孵育器。

2)按照以下示例检测板布局，将 100 µL 每种标准品分别加入两个孔中（此为示例，也可使用其他布局）。

3)按照示例检测板布局，将 100 µL 阴性对照分别加入两个孔中。

4)按照示例检测板布局，将 100 µL 每种样品稀释液分别加入两个孔中。

5)制备阳性产品对照，按照示例检测板布局（例如样品 1 加标孔），向两个孔中分别加入10 µL 浓度为 5.0 EU/mL 的标准品，然后加入 100 µL 样品稀释液。对每个检测样品均制备阳性产品对照。

6)在样品分析前，将检测板在 37 ± 1°C 预孵育至少 10 分钟。预孵育完成后再加入裂解物试剂。

7)在孵育期间准备裂解物试剂。

8)向所有检测孔中加入 100 µL 裂解物试剂。将检测板放入设置好的酶标仪中，用于动态显色法 LAL 检测，开启自动混合功能（低强度，10 秒），孵育器温度设定为 37 ± 1°C。确认选择多项式回归分析。

注：设置检测，使用三次多项式曲线评估数据，以获得最佳数据拟合。

9)读取检测结果：

按照显色检测方法设定，测量吸光度，检测时间为 1 小时，或直至最低浓度标准品达到起始吸光度（OD）。由于检测方法灵敏度较高，需确保检测时间足够长，以达到起始 OD 值。

 

示例检测板布局：

8 系统要求

1)检测中标准曲线的相关系数（r 值）绝对值必须大于或等于0.980。

2)标准曲线斜率必须在 -0.12 至 -0.35 之间。

3)为确保检测有效，阴性对照的平均反应时间必须大于最低标准浓度的反应时间，即阴性对照的内毒素浓度低于最低标准浓度。

4)为确保样品不会显著干扰 LAL / 内毒素反应，阳性产品对照的测量内毒素浓度必须在等效标准品名义浓度的 50% 至 200% 范围内。在确定阳性产品对照中加标内毒素是否回收之前，可能需要减去样品中测量的内毒素浓度，此计算由 Endoscan - V 软件完成。

5)标准品和样品重复检测的变异系数（% CV）必须≤10%。

若上述任何系统适用性或有效性标准未满足，则该检测可能被判定无效，需重复检测。

9 限值

不得超过 1 EU/mg

10 报告

结果以 EU/mg 报告，精确到整数位。未检测到内毒素时，结果报告为 < 0.05 EU/mg。

注：EU 和 IU 为等效计量单位。

 

参考文献：

 

[1]裴宇盛,陈晨,蔡彤,赵小燕,高华.中、美药典细菌内毒素检查法应用指导原则的比较和解读[J/OL].中国药物警戒:1-8[2022-11-03].DOI:10.19803/j.1672-8629.20211190.

 

[2] Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China Vol IV(中华人民共和国药典,四部)[S]. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 19.

 

[3]The United States Pharmacopeial Convention. U.S.Pharmacopeia 43/ National Formulary 38[M]. Baltimore: United Book Press, 2020.

 

 

来源：药事纵横

关键词： 细菌内毒素