1.实验背景

 

小鼠的疼痛检测方法多种多样，早期的文献和影响因子较低的文献所采用的试验方法都比较简单，比如弓背评分、行走评分、旷场实验等等行为学实验，都可以算作疼痛的直接和侧面反映。

 

而随着疼痛领域研究的不断深入，更多的高分文献开始对小鼠的机械性疼痛和温度疼痛分别讨论。前者常用的方法有Von Frey纤维丝刺激和进阶版的电子测痛仪，后者有冷热板实验、甩尾仪和足底热点仪等等。

 

考虑到结果的适用范围（更多文献都探讨的是机械性疼痛）和经济因素（机械性疼痛的检测仪器一般都要比热痛的检测仪器要便宜），我们这次以Von Frey纤维丝为基础，进阶到电子测痛仪上，来简单介绍一下小鼠的机械性疼痛的检测方法。

 

（图片来源：上海玉研科学仪器有限公司DanMic Von Frey纤维丝产品说明书）

 

2. 实验原理

 

VF纤维丝由Maximilian von Frey于1896年发明，通过不同直径的尼龙丝施加垂直压力刺激皮肤，利用欧拉屈服定律控制弯曲力，从而量化机械性疼痛阈值。其核心原理是：当纤维丝弯曲时，施加的力达到预设值，触发动物足部快速缩回反应（阳性反应）。

 

VF纤维丝由20根不同规格的纤维丝组成，每根纤维丝都分为纤维丝头、保护套和手柄三个部分。这些纤维丝的测量力度范围从0.008克到300克，覆盖了从极低到较高的触觉刺激强度。

 

在真正进行自己的实验时，大家应该是不会从0.008一直检测到300g的范围的，但是通常去购买VF纤维丝设备，都是一整套的，不会拆开来卖。

 

（图片来源：上海玉研科学仪器有限公司DanMic Von Frey纤维丝产品说明书）

 

3. 实验资料查询

 

在实验过程中，我们可以根据实际情况选择合适的粗细和长度（比如，对小鼠来说，用纤维丝刺激其后爪和腹部时，疼痛阈值通常会有所不同）。建议是根据自己的实验对象和实验设计去查找文献，主要关注一下以下方面：

 

3.1 采用的实验方法

 

比如，我自己在做试验方法调研的时候，总结出来的一些内容，就可以为更丰富的实验设计提供参考。

 

 

3.2 原文methods描述

 

还有一点很重要的内容是，在搜集文献参考的时候，不止要关注文献里面使用的试验方法，还要注意保存文献当中methods部分的描述，作为写文章时候的备用，如下：

 

 

3.3 实验结果的展示方法

 

 

4. 实验步骤

 

背景知识了解到这里就可以了，下面我们看看实验该怎么做（这一部分的具体数值仅供参考）。其实VF纤维丝的实验操作理解起来是不难的，只是要重复的次数太多非常繁琐，难度在于数据的处理，大小鼠50%缩足阈值的计算是比较复杂的。

 

up-down method，这是一种用于测量机械痛阈值的方法，目前是机械痛阈测量的金标准。

 

在测试前，根据前后肢位置标记刺激区域。

 

1. 将大鼠放置在一个底部为网格地板的亚克力笼中，适应30分钟（待动物安静后）后开始测试。一般检测

2. 平台会给配置三个大亚克力笼，供三只大鼠同时检测，每个大笼中插入十字隔板，足够12只小鼠同时进行检测。

（图片来源：上海玉研科学仪器有限公司DanMic Von Frey纤维丝产品说明书）

 

注意：下面是up-down method众多修订后的版本之一，并不能适用于所有情况！

 

3. 从中选择中位数4.0g的纤维丝，开始对小鼠脚掌中部皮肤进行刺激。将纤维丝弯至“C”或“S”型，并维持6-8秒，观察小鼠是否缩足并记录下来。每根纤维丝测试5次，每次间隔15秒，如果五次中有三次缩足，则认为小鼠有反应（这里每一根丝的重复次数要根据参考文献来自行决定，因不只是考虑到要简化实验流程节省时间，也因为纤维丝是损耗品，用的次数多了肯定会变得不准确的）。

 

4. 将小鼠的反应记录下来：无反应记为“O”，有反应记为“X”。如果小鼠无反应，则使用更大一级力度的纤维丝进行刺激（例如，如果4.0g的纤维丝没有引起反应，下一步则选择6.0g的纤维丝继续刺激）。如果有反应，则改用更小一级的纤维丝进行刺激（例如，如果4.0g的纤维丝引起了缩足反应，下一步则选择2.0g的纤维丝继续刺激），并反复进行这一过程。

 

5. 当小鼠出现“OX”（第一次没有缩足反应，第二次有缩足反应）或“XO”（第一次有缩足反应，第二次没有缩足反应）的情况时，重复之前的步骤，并继续测量四次，得到一串由“O”或“X”组成的序列。将该序列与最后一根测试丝的编号输入到小鼠50%缩足阈值公式中，计算出小鼠的50%缩足阈值。

 

6. 小鼠50%缩足阈值的计算公式为：(g) = (10 × [Xf + kδ]) / 10000，其中Xf为最后一根测试丝的编号，δ为所选各根纤维丝克数取对数后的均差。为了方便计算，δ可以近似认为是所选纤维丝编号的均差，即δ = (最大纤维丝编号 - 最小纤维丝编号) / (n - 1)，其中n为所选纤维丝的数量。k是根据测量获得的“X”、“O”序列查表后获得的系数值。

 

7. 计算公式大家理解其意义即可，因为确实挺麻烦，网络上其实可以找到50%缩足阈值的计算的软件， 简化数据采集后阈值计算的复杂程度，大家在记录完自己的数据以后可以咨询购买仪器的公司或者在网上进行查询，比如Up-Down Reader（UDReader）。

 

5. 注意事项

 

正式试验开始前的适应阶段非常重要。

如果观察到实验鼠的脚趾明显张开，这可能意味着在下一级压力测试中，更接近于其真实的痛觉阈值。

防止实验鼠咬住Von Frey纤维丝。

注意纤维丝的使用次数和损耗程度。

 

6. 电子测痛仪

 

接下来稍微讲一下电子测痛仪，按理说，电子测痛仪完全是VF纤维丝的上位替代，能够自动记录动物的受刺激强度，操作起来的确比VF纤维丝要简单方便，在实验操作和原理上就不赘述了。

 

电子测痛仪的缺点是价格较高，通常比VF纤维丝贵一倍以上，超过1万元。还有另一个缺点是，目前市面上绝大多数（包括进口的售价高达数万的）电子测痛仪的分辨率都是0.1g。

 

但从上面我们知道VF纤维丝是从0.008g开始的，整个绿色部分的力度都没有达到0.1g，所以如果你的实验设计当中小鼠的机械疼觉相当敏感，它的机械痛阈值很低的话，电子测痛仪就不再适合了。

 

7. 参考资料

 

[1] https://brainstuff.org/blog/von-frey-fibers-pain-test

 

[2] https://ibook.antpedia.com/x/873727.html

 

[3] https://ibook.antpedia.com/x/980252.html

 

[4] https://zhuanlan.zhihu.com/p/486531321

 

[5] https://zhuanlan.zhihu.com/p/266692130

 

[6] http://www.yuyanbio.cn/product-item-761.html

 

来源：实验老司机

关键词： 疼痛检测实验