摘 要： 建立丹酚酸B标准物质研制方法。采用乙醇提取丹参，浓缩后，大孔树脂净化，制备液相提纯的方式研制丹酚酸B标准物质。采用高效液相色谱法对丹酚酸B标准物质纯度进行测定，并进一步通过测定样品的水分，炽灼残渣和溶剂残留的测定，通过质量平衡法和核磁共振法测定样品中丹酚酸B的含量，最后对定值结果的不确定度进行评估。质量平衡法测得标准品中丹酚酸B的含量为94.63%，扩展不确定度为0.27%，核磁共振法测定结果为95.1%，两种方法定值结果基本一致。对标准物质的的均匀性和稳定性进行考察，研制得到的丹酚酸B标准物质均匀性良好，稳定性满足1年要求，能够满足丹酚酸B标准物质研制要求。

关键词： 丹酚酸B； 标准物质； 定值； 均匀性； 稳定性； 不确定度

 

丹酚酸B是由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成的，分子结构如图1所示。丹酚酸B在水中的稳定性较差，加热条件下容易裂解[1]，通常对抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡、保护大脑和肝脏、抗肿瘤、治疗糖尿病和视网膜疾病有着较好的效果[2‒4]，是研究较为广泛的一种丹酚酸类物质。目前市场上所售丹酚酸B标准品种类繁多，但质量层次不齐，这会直接影响到丹酚酸B测量结果的准确性，因此研制丹酚酸B标准物质显得尤为重要。

图1   丹酚酸B分子结构图

Fig. 1   Structure of Salvianolic Acid B

标准物质是一类具有很好特性值，用于校准测量仪器，评价测量方法，给一般物质赋值的材料或者物质[5‒6]。标准物质特征量值的准确性取决于标准物质定值方法的准确性，因此需要高精密度、高准确度的分析方法。常用于标准物质定值的方法主要有质量平衡法[7‒8]、定量核磁法[9‒10]、热分析法[11‒12]和滴定法[13‒14]。其中，质量平衡法是基于被测物质主成分与水分、残留溶剂、无机杂质之和为100%的原理上[15]，通过测定样品纯度、水分、溶剂残留和炽灼残渣的含量来计算样品主成分含量，该方法操作简单，对实验条件环境要求低，不受不同物质之间理化性质差异的影响，是一种在标准物质领域常用的定制方法。

笔者采用乙醇提取丹参，浓缩后，经大孔树脂净化，制备液相提纯的方式研制丹酚酸B标准物质，用质量平衡法和核磁共振法对丹酚酸B进行定值，并对测量结果的不准确度进行评估，保障了丹酚酸B定值结果的准确性和可靠性，并对丹酚酸B的均匀性和稳定性进行考察。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

制备液相色谱仪：NP7010C型，配紫外检测器，江苏汉邦科技股份有限公司。

高效液相色谱仪： 1260型，配二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：（1） XPE205型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；（2）BSA224S-CW 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

电热鼓风干燥箱：DHG-9245A型，上海一恒科学仪器有限公司。

马弗炉：1100Box Fumace型，美国赛默飞世尔科技公司。

气相色谱仪：7890B型，配FID检测器，美国安捷伦科技有限公司。

顶空进样器：1900型，美国安捷伦科技有限公司。

核磁共振仪：600型，德国布鲁克公司。

超纯水仪：Synergy UVR型，德国默克公司。

丹酚酸B对照品：质量分数为97.5%，批号为11156-202318，中国食品药品检定研究院。

1,4-二硝基苯：质量分数不小于98%，美国西格玛公司。

AB-8大孔树脂：孔径为1 000~250 μm（16～60目），成都艾科达化学试剂有限公司。

丹酚酸B样品：宝鸡翊瑞生物科技有限公司。

甲醇为、乙腈、磷酸、N,N-二甲基亚酰胺，乙酸乙酯：均为色谱纯，德国默克公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱

（1）纯度测定。色谱柱： CP-C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，三耀精细化工品销售（北京）有限公司]；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（体积比为22∶78）；柱温：20 ℃；流量：1.0 mL/min；检测波长：286 nm；进样体积：10 μL。

（2）制备、纯化。色谱柱：ODS-2柱（250 mm×20 mm，10 μm，江苏汉邦科技有限公司）；流动相：纯甲醇；流量：10 mL/min；进样量：5 mL。

1.2.2 气相色谱

色谱柱： DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司）；升温程序：40 ℃保持8 min，然后以10 ℃/min速率升温至220 ℃，保持3 min ；载气：氮气；流量：1 mL/min；进样口温度：200 ℃；检测器温度：250 ℃；分流比：1∶10。

1.2.3 顶空进样

平衡温度：80 ℃；平衡时间：30 min。

1.3 实验步骤

1.3.1 标准物质制备

称取1 kg丹酚酸原料药材，加入10 L 70%的乙醇，加热搅拌提取3 h，用快速定性滤纸过滤，取滤液，减压浓缩至500 mL，加入已活化处理好的AB-8大孔吸附树脂中，用水淋洗，再用50%乙醇淋洗除杂，用80%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至乙醇完全除去，用定量滤纸过滤，将溶液注入制备液相色谱仪，按1.2.1中制备液相色谱条件进行分离纯化，收集相应的组分，浓缩至浸膏，-40 ℃冷冻干燥后，分装于200个棕色玻璃瓶中，每瓶100 mg，于-20 ℃冷冻，避光保存。

1.3.2 样品预处理

（1）质量平衡法。精密称取丹酚酸B对照品10 mg，分别称取2份，加甲醇-水混合溶液（80∶100），溶解制成100 μg/mL丹酚酸B对照品溶液。精密称取2份丹酚酸B样品25 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液（80∶100）溶解，并定容至标线，制得每1.0 mg/mL溶液，摇匀后，过滤，取续滤液，即得待测样品溶液。

（2）水分测定。采用《中华人民共和国药典》2015版四部水分测定法进行测定，精密称取1 g的丹酚酸B样品平铺于以已干燥恒重的扁形称量瓶中，于105℃恒温干燥至恒重。

（3）炽灼残渣测定。采用《中华人民共和国药典》2015版四部炽灼残渣检查法进行测定，精确称取1～2 g丹酚酸B样品至已灼烧至恒重的坩埚中，200 ℃缓缓炽灼至完全碳化，放冷至室温，加入硫酸0.5 mL使其湿润，低温加热至硫酸蒸气完全除尽后，于750 ℃条件下炽灼使其完全灰化后，移入干燥器内，放冷至室温，精密称重，再置于750 ℃条件下炽灼使其达到恒重。

（4）溶剂残留的测定。根据《中华人民共和国药典》2015版四部残留溶剂测定法进行测定。分别精密称取25 mg甲醇、乙腈、乙酸乙酯于同一100 mL容量瓶中，加DMF稀释并定容至标线，得到含0.25 mg/mL甲醇、乙腈和乙酸乙酯的溶液。精密称取丹酚酸B样品0.2 g于10 mL容量瓶中，加入DMF溶解后定容至标线，摇匀，即得。准确分别移取丹酚酸B对照品溶液和待测样品溶液各5 mL于2个20 mL顶空瓶中，密封，顶空进样，进行测定。

（5）核磁共振法。取丹酚酸B样品20 mg及内标物1,4-二硝基苯10 mg，平行称取3分，加入2 mL DMSO-d6溶解后，取1 mL样液加入核磁管中，扫描丹酚酸B与内标物1,4-二硝基苯图谱。

1.3.3 定量方法

根据质量平衡法计算结果，将丹酚酸B对照品溶液和样品溶液分别注入液相色谱仪进行测定，以保留时间定性，采用面积归一化法计算样品中丹酚酸B的纯度。根据水分测定样品减失的重量计算样品水分含量。炽灼残渣测定根据样品灼烧后剩余的样品重量计算炽灼残渣的量。样品中的溶剂残留，以色谱峰保留时间定性，计算样品中甲醇、乙腈、乙酸乙酯的残留量。

采用样品含量=样品色谱纯度×(100%-干燥失重-炽灼残渣量-溶剂残留量，计算样品中丹酚酸B的含量。

采用核磁共振法计算结果，采用氢谱，选择1,4-二硝基苯为内标，经过软件处理后计算样品的含量。

1.3.4 均匀性检查

随机抽取15个最小包装单元，每个单元平均抽取3个子样，每份称样量为10 mg，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的甲醇-水溶液，采用高效液相色谱法对纯度进行测定，通过F检验法对标准物质均匀性进行评价。

1.3.5 稳定性考察

（1）长期稳定性考察。在标准物质储存后0、1、3、6、8、12个月进行抽样检验，每次抽取2个单元，运用高效液相色谱法对纯度进行检测。

（2）短期稳定性考察。将样品于20 ℃和40 ℃保存，第0、1、3、5、7 d进行抽样检验，每次抽取2个单元，采用高效液相色谱法对纯度进行检测。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 样品定值

2.1.1 水分含量

8名实验室工作人员采用2.3方法对同一批次的丹酚酸B样品进行水分含量的测定，试验结果见表1。由表1可知，测定结果的平均值为2.82%，其相对标准偏差为3.47%。

表1   丹酚酸B样品水分测定结果

Tab. 1   Result of moisture content ( % )

 

2.1.2 炽灼残渣

选择实验室8名工作人员，按2.4方法对同一批次丹酚酸B样品进行炽灼残渣量的测定，8个独立平行结果见表2。由表2可知，平均炽灼残渣量为0.141%，测定结果的相对标准偏差为1.71%，客观的反映了丹酚酸B样品中无机杂质的残留量。

表2   丹酚酸B样品炽灼残渣

Tab. 2   Burning residue of sample B of salvianolic acid ( % )

 

2.1.3 溶剂残留

选取8名实验室工作人员，按照2.5方法对同一批次丹酚酸B制备过程中使用到的甲醇、乙腈和乙酸乙酯的残留量进行测定，试验结果见表3。

表3   丹酚酸B样品溶剂残留

Tab. 3   Residual solvent in sample B of salvianolic acid ( % )

 

由表3可知，8名实验人员测得同一批次丹酚酸B样品中乙腈的残留量均为0，表明乙腈未被检出，但却在样品中发现了甲醇和乙酸乙酯的残留。8名实验人员测得甲醇残留量平均结果为0.194%，测定结果的相对标准偏差为4.08%；乙酸乙酯残留量的平均结果为1.19%，测定结果的相对标准偏差为6.36%，该方法的准确度符合要求。

2.1.4 纯度测定

8名实验室工作人员分别采用Aglient1260型液相色谱仪（仪器1）、U3000型液相色谱仪（仪器2），按照2.2方法和色谱条件对同一批批丹酚酸B样品进行纯度分析，丹酚酸B样品色谱图见图2。由图2可知，丹酚酸B样品中有其他杂质峰的检出，因此采用面积归一化法计算样品的纯度。

图2   丹酚酸B液相色谱图

Fig. 2   HPLC chromatogram of Salvianolic Acid B

在研究工作中，采用高效液相色谱法测定样品的纯度，并采用不同的实验人员和不同型号的仪器进行对比，丹酚酸B样品纯度测定结果见表4。由表4可知，不同实验人员不同型号的仪器测定结果较为接近，证明样品的纯度测定结果较为准确可靠。8名实验人员分别采用仪器1、仪器2测得样品纯度（质量分数）平均值分别为98.92%、98.98%，测定结果的相对标准偏差分别为0.32%、0.21%，表明8名实验人员的结果较为一致，且两种仪器测定结果基本一致，客观地反映了样品纯度的真实情况。

表4   丹酚酸B样品纯度测定结果表

Tab. 4   Result of Purity of samples ( % )

 

2.1.5 样品含量

根据质量平衡法计算样品中丹酚酸B、水分、溶剂残留、无机杂质以及样品中主成分的含量之和应该等于1。样品含量=样品色谱纯度×(100%-干燥失重-炽灼残渣量-溶剂残留量)= 98.92%×(100%- 2.82%-0.14%-0.19%-1.19%)=94.63%。

质量平衡法计算丹酚酸B样品中丹酚酸B的含量，操作过程如2.1.1~2.1.4中所述，操作过程简单，需要的仪器设备简单，对实验条件和环境要求较低，易于实现。虽然测定过程涉及到纯度，干燥失重，炽灼残渣以及残留溶剂等多个环节步骤的测定，但从试验结果来看，多个人员测定样品的纯度，干燥失重，炽灼残渣和溶剂残留的结果来看，结果较为接近，精密度和准确度都较好，样品含量测定的可靠性较高，可以作为标准品定值的常用方法。

2.1.6 不确定度

通过2.1.1~2.1.4中测定样品纯度、干燥失重、炽灼残渣、溶剂残留的8组测量结果，根据格拉布斯准则，进行可疑值判断，显示结果无可疑值后，计算得到合成标准不确定度[16‒17]：Uc（c）= c×{}1/2 = 0.11 4%。其中，c为样品含量，Uc（P）为样品纯度的不确定度，P为样品纯度，Uc（M）为干燥失重不确定度，Uc（A）为炽灼残渣的不确定度，Uc（J）为甲醇残留的不确定度，Uc（E）为乙酸乙酯残留量的不确定度，M为干燥失重量，A为炽灼残渣量，J为甲醇残留量，E为乙酸乙酯残留量。

扩展不确定度为U=Uc（c）×k；k为包含因子，置信概率P=0.95，自由度n=8-1=7，查t分布表，得到k=2.36，因此由质量平衡法测得丹酚酸B含量得扩展不确定度为U=2.36×0.001 14=0.0 0269。由质量平衡法计算得到样品中丹酚酸B的含量为94.63%，扩展不确定度为0.269%。

2.1.7 核磁共振定值结果分析

根据扫描得到的丹酚酸B和内标物1,4-二硝基苯的核磁共振谱图见图3。

图3   丹酚酸B和内标物1，4-二硝基苯核磁共振图

Fig. 3   NMR spectra of salvianolic acid B and internal standard 1，4-dinitrobenzene

选择内标物1,4-二硝基苯特征峰δ 8.40作为内标定量峰，目标物丹酚酸B特征峰δ 5.70为丹酚酸B定量峰，计算丹酚酸B含量，测定结果见表5。由表5可知，测定结果的相对标准偏差为0.8%，核磁共振定值法测得丹酚酸B样品平均含量为95.1%，与质量平衡法测得结果（94.6%）基本一致，虽然质量平衡法测定标准品纯度涉及多个测定环节，但操作较为简单，在一般的分析实验室较为容易实现，结果准确可靠。

表5   丹酚酸B样品纯度测定结果（核磁共振法）

Tab. 5   Result of Purity of samples（NMR） ( % )

 

2.2 均匀性检验

采用高效液相色谱进行测定，随机抽取15个最小包装单元，每个单元抽取3个字样，每份称样量为10 mg，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的甲醇-水溶液，用高效液相法测定其纯度测定结果见表6。

表6   丹酚酸B均匀性测定结果

Tab. 6   Result of homogeneity of samples

 

由表6可知，平均质量分数为99.09%，平均偏差s=0.017，组间方差S12=0.000 317，组内方差S22=0.000 201，F=1.58，查表得F0.05（14，30）=2.04，F＜F0.05（14，30），表明样品均匀性良好。

2.3 稳定性检验

在标准物质储存后0、1、3、6、8、12个月进行抽样检验，每次抽取2个单元，每份称样量为10 mg，配制成浓度为0.1 mg/mL的甲醇水溶液，按照1.3.5方法进行长期稳定性考察。其测定结果最大值为99.21%，最小值为98.69%，样品纯度变化不明显，说明样品在标准储存条件下12个月内稳定性良好。将样品储存在20 ℃和40 ℃保存，第0、1、3、5、7 d进行抽样检验，每次抽取2个单元，每份称样量为10 mg，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的甲醇水溶液，按照1.3.5方法进行长期稳定性考察。其测定结果最大值为99.27%，最小值为98.76%，样品纯度变化不明显，说明样品在短期运输条件下7 d内稳定性良好。

 

3. 结语

 

研制了丹酚酸B标准物质，运用质量平衡法和核磁共振法对其定值进行研究，对测量结果的不确定度进行评估，并对研制标准物质的均匀性和稳定性进行考察。结果表明，研究所用样品中丹酚酸B的含量为94.63%，扩展不确定度为0.27%。核磁共振定值结果为95.1%，与质量平衡法定值结果一致，制得丹酚酸B标准物质均匀性良好，稳定性良好，该方法可用于丹酚酸B标准物质的制备。

 

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引用本文： 林芳，赵俊楠，吕卓，等 . 丹酚酸B标准物质研制［J］. 化学分析计量，2024，33（12）： 1. (LIN Fang, ZHAO Junnan, LYU Zhuo, et al. Develoment of salvianolic acid B purity reference material[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 1.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 丹酚酸B