1. 实验原理

 

细胞热位移实验（CETSA）的核心原理依赖于蛋白质对热稳定性的不同响应。即配体与靶蛋白结合后，可提高蛋白的热稳定性，使其在相同温度下相比于天然蛋白更不容易发生变性。

 

相较于未结合药物的游离蛋白，这类受配体保护的蛋白在同一温度条件下能保持较高比例的天然结构，从而减少降解产物的产生。

 

（图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Cellular_thermal_shift_assay）

 

实验过程中，通过在不同温度条件下检测蛋白的完整性或溶解性，可以间接评估药物与靶蛋白的结合情况。这种方法广泛用于鉴定小分子药物的作用靶点，研究蛋白稳定性的调控机制，并在药物筛选和机制研究中发挥重要作用。

 

2. 实验材料

 

耗材：10cm培养皿、6cm培养皿、PCR管、6孔板

试剂：NP-40缓冲液、蛋白酶抑制剂、2×SDS Loading Buffer、SDS-PAGE凝胶试剂、DMSO

仪器：CO2培养箱、倒置荧光显微镜、PCR仪、离心机

 

3. 实验步骤

 

3.1 细胞培养与处理

 

培养293T细胞，确保状态良好，铺6孔板，密度大约在70%左右，可根据实验设计在细胞内转染目的蛋白质粒。

 

3.2 药物孵育

 

随后将细胞暴露于DMSO或实验药物X中，37℃培养24 h，以确保药物能够充分与靶蛋白结合。

 

3.3 细胞收集与预处理

 

孵育结束后，收集细胞并用含蛋白酶抑制剂（1 mmol/L PMSF或者50×cocktail）的PBS清洗2次。胰酶消化后离心弃上清，将细胞重悬于PBS（不含蛋白酶抑制剂）中，细胞计数以调整细胞密度至2×10⁷ cells/mL。

 

3.4 温度梯度处理

 

将细胞均分至多个PCR管中（50 μL），确保每管含有等量的细胞。使用PCR仪或加热装置，在一系列不同温度梯度（如37℃至67℃）下加热3 min，室温冷却3 min，并在冰上保持，使蛋白质发生不同程度的热变性（做3个重复）。

 

3.5 细胞裂解与蛋白提取

 

热处理结束后，使用NP-40缓冲液重悬细胞，并通过液氮冻融循环3次，以彻底裂解细胞并释放蛋白质。然后，在4℃条件下，以20,000×g离心20 min，收集上清液，其中富含未变性的蛋白，而沉淀部分主要包含已变性的蛋白。

 

3.6 蛋白检测

 

取20 μL上清液，与等量的2×SDS Loading Buffer混合，在金属浴中加热煮蛋白10 min，使蛋白充分变性。之后可进行Western blot实验检测目标蛋白的含量。如果需要更精细的蛋白质分析，可将上清送至专业机构进行质谱检测，以解析蛋白的稳定性及药物作用机制。

 

如图为将裂解物与100μmol/L Dem一起孵育5-10 min，发现Dem在所有温度下都显著促进了USP22蛋白的降解，甚至在室温下也是如此。 图片

 

如图为CETSA用于测定USP22与Dem（一种药物）在短时间药物暴露（5 min）下的一系列温度范围内相互作用的热不稳定性[1]

 

4. 注意事项

 

作为对照组使用的DMSO，其终浓度应控制在不影响细胞生长的范围（通常≤0.1%）；

 

加热时间：通常控制在3-5 min，时间过短可能导致蛋白未充分变性，过长可能引起非特异性降解；

 

NP-40或Triton X-100缓冲液可用于温和裂解，避免使用过强的裂解条件（如SDS），否则可能影响蛋白的稳定性；

 

液氮冻融即将8连排管缓慢放入液氮冷冻1-2 min，取出后迅速置于37℃恒温水浴锅使其融化，重复操作，共3次。

 

5. 参考资料

[1]Zhang Y, Huang Y, Yu D, Xu M, Hu H, Zhang Q, Cai M, Geng X, Zhang H, Xia J, Guo M, Lu D, Xu H, Li L, Zhang X, Wang Q, Liu S, Zhang W. Demethylzeylasteral induces PD-L1 ubiquitin-proteasome degradation and promotes antitumor immunity via targeting USP22 [J]. Acta pharmaceutica Sinica B, 2024, 14(10): 4312-4328.

 

来源：实验老司机

关键词： 细胞热位移实验