1.概述

 

国家药品监督管理局食品药品审核查验中心（CFDI）于2025.1.17发布《清洁验证技术指南》[1]，该指南详细描述了清洁验证执行过程中的各项要求，以指导和规范药品上市许可持有人、药品生产企业（包括原料药登记人）等对药品生产设备及部件的清洁验证进行科学管理，确保患者用药安全。众所周知，药品生产设备在生产结束后，需按照规定的清洁程序进行清洁。设备上的残留物必须达到规定的清洁限度要求，才不会对接下来生产的产品造成交叉污染。而确定残留物是否达到规定的清洁限度要求，离不开对残留物进行检验。因此，建立准确可靠的清洁验证后残留物分析方法会对判定设备清洁程度起到举足轻重的作用。本文笔者将论述清洁验证后残留物分析方法开发与验证要点，以便为广大研究者在清洁验证分析方法建立方面提供参考。

 

2.残留物分析方法开发

 

设备表面在生产时会有少量样品残留，再经过清洗、清洁，残留的量会更少，且设备经过清洁后也会有少量的清洁剂残留。企业一般规定残留限度为10ppm甚至更低。由于残留量低，常量分析无法达到，只能采用半微量分析、微量分析甚至痕量分析，所以需要开发满足需求的检测方法。如果分析方法选取不当，灵敏度低，残留量有可能低于检测限而不易检出。

 

2.1 残留物分类

 

确定残留物类型、性质甚至结构是开发残留物分析方法的基础和前提，其中，对残留物进行分类是第一步：按照测试对象可分为中间体、活性成分、辅料和清洁剂；按照残留物的结构或性质可分为有紫外吸收的化合物和无紫外吸收的化合物。

 

2.2 分析方法的选择原则

 

残留物分析方法的选择常遵循四项原则：高灵敏度、尽可能高的取样回收率、良好的精密度和简单快速。

 

2.2.1 高灵敏度：

 

由于残留物限度较低，所选择的分析方法必须有高灵敏度；

 

2.2.2 尽可能高的取样回收率：

 

残留物分析方法往往存在取样回收率较低的问题，即使具有同样的表面残留量，取样后样品的检测结果也会有很大差异，故《药品生产验证指南》规定取样回收率和方法回收率的综合回收率不低于50%，多次取样的回收率的RSD不大于20%，对于回收率的要求较宽松。而实践中，取样回收率大约在70%-85%，而RSD一般在5%-15%。建议选择的分析方法，其取样回收率在75%以上，RSD不大于10%，尽可能提高分析方法的准确度；

 

2.2.3 良好的精密度：

 

样品取样回收率较低已经对检测准确度产生了影响，如果分析方法精密度差，检测误差容易产生叠加，产生更大的误差，这就失去了检测监控的意义，所以分析方法必须有良好的精密度；

 

2.2.4 简单快速：

 

许多企业都是连续性生产，生产结束后清场、清洁、取样检验，需要很快知道清洁效果和确定是否可以继续生产下一批产品，这就需要检验的及时快速，而这就取决于分析方法是否简单快速。

 

此外，分析方法的选择还应考虑到可用的仪器、检测技术的专属性、取样限制（包括取样溶剂）、响应值是否呈线性、能否在线检测、检验成本等因素。

 

2.3 分析方法类型

 

2.3.1 常用分析方法

 

常用的分析方法可以分为专属性方法和非专属性方法。前者的典型代表为高效液相色谱法，后者的典型代表为总有机碳法。常用的分析方法见表1。

 

▲表1-常用的分析方法

 

2.3.2 其他分析方法

 

除常用的分析方法，基于不同的产品类型，亦可在残留物分析时采用表2中的方法或表中未列出的其他方法。

 

▲表2-常见的其他分析方法

 

2.3.3 微生物和细菌内毒素分析方法

 

微生物残留的控制也是清洁验证的一个重要部分。微生物残留包括生物负载和细菌内毒素。通常，如果下一个产品质量标准中有细菌内毒素检查项，应当在清洁验证中进行该项目的检测，分析方法通常是药典方法（药典四部通则1143[2]）。如不进行细菌内毒素的检测需要进行科学的评估。

 

2.4 分析方法的选择

 

2.4.1 基于方法的专属性

 

分析方法的选择取决于清洁后的残留物性质，应当考虑清洁过程中活性成分是否发生变化（如降解）。活性成分如果未发生变化，首选专属性分析方法；活性成分如果发生变化，则应当选择专属性和非专属性两个方法。如果只能采用非专属性分析方法，应当经过充分评估和论证。

 

基于全生命周期管理的原则，在清洁验证的不同阶段可能使用不同的分析方法来评价残留物。开发阶段早期，可能还未获得残留物的足够信息（例如活性成分是否降解），并且特定的分析方法可能也尚未经过验证。清洁工艺开发时，可采用电导率、pH或者总有机碳法（TOC）等具有良好耐用性和通用属性的非专属性方法，并且这些方法对包括残留标记物在内的大部分成分也会有响应。

 

2.4.2 基于残留物的性质

 

对于有紫外吸收的化合物，可以采用紫外-可见分光光度法，亦可采用高效液相色谱法。对于单一化合物，分析方法开发时，如果已有该化合物的紫外或高效液相的检测方法时，可以直接采用，如目标残留物为活性成分，可直接采用含量测定的方法，但是必须再次实施方法验证，重点考查检测限或定量限能否达到要求。如果能够达到要求，且吸光度满足准确度验证的要求，最好采用紫外分光光度法，如果采用高效液相色谱法，方法开发投入的时间会很多，比如色谱柱、流动相类型、流动相的pH值、缓冲盐浓度的选取等；如果已有的检测方法的检测限或定量限无法达到要求，则需调整分析方法或更换其他分析技术，直至灵敏度达到要求，例如，有研究者在开发阿西替尼清洁验证残留物分析方法时，其API残留分析方法借鉴阿西替尼含量测定方法的HPLC色谱条件，在该色谱条件上进行了进样量的调节、色谱柱的改变、梯度的调整，以及根据清洁验证擦拭取样的特点进行了擦拭方法的筛选，最后完成了线性、定量限、检测限、准确度、精密度和专属性的验证，从而建立了符合要求的清洁验证中阿西替尼残留分析方法[3]。对于复方制剂，考虑到专属性，建议优先使用高效液相色谱法。只有一种特例可以使用紫外分光光度法测定，那就是组分之间的吸收峰不互相干扰，吸收波长差异较大，则可以将不同组分在不同波长下分开测定[4]。

 

对于无紫外吸收的化合物,有以下五种测定方法可供选择：

 

（1）采用紫外-可见分光光度法中的比色法。比色法是指供试品本身在紫外- 可见光区没有强吸收，可加入一定量的显色剂与供试品反应，使反应产物在紫外或可见光区有强吸收，此过程也称显色反应。由于过程是化学过程，显色剂的选择至关重要，检测时还得考虑显色剂的用量；溶液酸度对显色反映的影响；反应温度；反应时间以及反应的可逆性等众多因素，此外此方法无法对残留物进行准确定量，所以这种方法一般不被企业所采用。

 

（2）对待测物进行柱前衍生，以提高其在紫外-可见光区的响应。此方法与上述比色法原理相同，即加入带有发色基团的衍生试剂与待测物反应，生成稳定的、具有紫外吸收的物质，进而可通过液相色谱法（紫外检测器）或紫外-可见分光光度法进行检测。例如，胺类物质常用酰氯类（对甲苯磺酰氯、苯甲酰氯、Fmoc-Cl等）或醛类（苯甲醛、对二甲基苯甲醛等）作为衍生试剂。柱前衍生法虽然可提高待测物的紫外响应，但是存在操作较繁琐、对反应条件要求高、有可能产生多种衍生化产物，引入其他杂质，给色谱分离带来困难和有时重现性差的缺点，因此不建议将此法作为优先选项。

 

（3）对于沸点低、易气化和热稳定性好的化合物可采用气相色谱法。气相色谱仪的检测灵敏度可以满足大多数清洁验证残留物质的检测，限度为2ppm都可以满足。气相检测方法在进行分析方法验证时，如果采用顶空进样，需要考虑气液平衡过程中的基质效应(供试品溶液与对照品溶液组成差异对顶空气-液平衡的影响)，进行准确度验证时，可采用标准加入法进行测定，标准加入法可以消除供试品溶液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响。

 

（4）对于沸点高、难气化或热稳定性差的化合物可采用液相色谱串联其他检测器法，如ELSD、CAD、MS。其中ELSD和CAD为质量型检测器，理论上对所有物质均有响应，且这两种检测器灵敏度较紫外检测器更高，而MS的灵敏度和分辨力极高，在痕量物质的检测方面得到广泛应用。但以上几种检测器的线性范围较窄，耐用性不如紫外检测器高，在实际开发方法过程中，可与第二种柱前衍生法对比研究，以选出最适合的方法。

 

（5）采用TOC法进行测定。TOC法常用来检测制药用水中的有机碳总量，用以间接控制水中有机物含量。2005年,FDA提出制药行业TOC方法检测清洁后的残留物是可行的[5]。有研究者用TOC法实现了注射用奥美拉唑钠清洁后残留奥美拉唑的测定，他们用标准曲线法定量测定残留奥美拉唑，结果表明奥美拉唑呈现良好的线性关系，无论是喷淋清洁还是棉签擦拭清洁后奥美拉唑残留量均符合要求[5]。然而，此法用于测定残留物仍有一定的局限性，残留化合物在水中应具有一定的溶解度，而且测定时需要快速，样品从取样到检测不宜超过30min。另外，样品须密封保存，防止空气中CO2的进入而影响测定结果。方法验证时，线性测试由于受到外部干扰，所以TOC法一般用于限度检查，对于定量测定还是有一定难度。

 

3.分析方法验证

 

残留物的分析方法应该在清洁验证开始之前，即清洁工艺确认前，就完成其自身的分析方法验证，才能给设备清洁验证过程残留物的检验和结果的准确判定提供依据。如果引用药典方法，由于清洁检测的含量水平较低，其响应值、精密度等指标可能会与药典方法不同，也应当进行适当项目的验证。细菌内毒素检验方法通常是药典方法，无需进行方法验证，确认其适用性即可。对于成分较为复杂产品（如含有螯合剂、表面活性剂等），则需进行细菌内毒素干扰试验的研究。

 

清洁验证的重点之一是确定残留限度（限度的计算方法详见《清洁验证技术指南》中4.5章节，笔者也将在后续文章中分享相关内容，故在此不做赘述），然后使用分析方法测定清洁后设备表面的残留，分析方法应当经过适当的验证。分析方法的验证应按照《中国药典》的要求进行，通常验证性能特征有准确度、精密度、专属性、响应（线性、非线性、多变量）、范围、范围下限（定量限、检测限）和耐用性等，详见表3。定量限/检测限必须低于样品的可接受限度，以确保清洁程序的耐用性。考虑到取样样品和检测间隔有一定时间，还应当评估贮存条件（时间、温度、贮存的小瓶等）对样品稳定性的影响。专属性方法还应关注干扰物（如清洁剂等）可能带来的影响。值得一提的是，准确度验证中除了方法本身回收率外，还应包括取样回收率，如棉签擦拭回收率、冲洗后不锈钢板回收率等。

 

对于使用定性方法来进行清洁验证时，可不进行全面的分析方法验证。其准确性和精密度通常只需在残留限度水平进行，无需进行线性和范围的验证。

 

使用TOC 法测定时，如果结果大于500ppb，需建立线性范围等证明TOC 方法的适用性。

 

▲表3-清洁验证中残留物分析方法验证项目

 

+表示此项特征通常需要评价；-表示此项特征通常不需要评价。

 

设备清洁残留物的分析方法经过验证后，同样要遵循分析方法生命周期管理的原则[6]，当情况发生改变时要进行再验证，如分析技术的变更、待分析物的变化、生产工艺的改变或清洁工艺的改变等，都可能影响原分析方法确定待分析物水平的准确性，分析方法也需要随之进行部分或完全再验证[7]。

 

4.结语

 

本文笔者以《清洁验证技术指南》为基础，结合其他文献，总结了清洁验证后残留物分析方法开发与验证要点，为广大同行提供思路。生产设备清洁程度的判定离不开准确可靠的残留物分析方法，建立持续可行的清洁验证残留物分析方法，将为生产工艺持续高效运转提供坚实保障。

 

参考文献

 

[1] CFDI：《清洁验证技术指南》.

 

[2]《中国药典》四部通则1143细菌内毒素检查法.

 

[3] 贺佩兰. 阿西替尼及其清洁验证中残留物的HPLC分析方法研究[D]. 浙江工业大学，2019.

 

[4] 管玉华，徐春明. 药品清洁验证中残留物检测的分析方法选择[J]. 中国医疗前沿，2013, 8(22): 92-92, 96.

 

[5] 李明，曲楠楠，董春柳. TOC分析方法在制药设备清洁验证中的应用举例[J]. 生物技术世界，2016, (2): 201.

 

[6] ICH Q2(R2): Validation of Analytical Procedures.

 

[7] 陈雯秋. 清洁验证中的分析方法学验证[J]. 中国药业杂志，2005, 14(4): 17-19.

 

 

 

来源：注册圈

关键词： 药物清洁验证