嘉峪检测网 2025-05-07 08:30
导读：本文从《蛋白质分离与纯化技术》中摘录了三种从不同类型的样本中分离膜蛋白的方法。
1. 前言
膜蛋白可以分为外在膜蛋白与内在膜蛋白，前者相对后者较容易提取，而后者几乎只能通过使用去污剂分解膜增溶才能分离。本文从《蛋白质分离与纯化技术》中摘录了三种从不同类型的样本中分离膜蛋白的方法。
图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Fluid_mosaic_model
2. 细胞膜蛋白的分离方法
实验步骤（此处为贴壁细胞）：
1. 收集待裂解细胞，冰上处理，去除上清（培养基），用pH 7.4 的 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤单层细胞两次。
2. 加人1 mL 2% Triton X - 114溶液，冰浴15 min。
3. 4℃下以10000 ×g离心5 ~10 min。
4. 37℃水浴10 min 以分离水相和去污剂相（有机相），然后在37℃下以2000 ×g离心10 min。
5. 收集水相留待后续分析。
6. 用500 μL冰冷的Buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2 min后升温，按步骤3的操作再次进行离心。
7. 再次抽提去污剂相，随后用Buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积。
8. 用等量的Buffer A分别稀释水相与去污剂相，并进行免疫沉淀实验验证。
所用试剂配方：
● 2%Triton X - 114
成分
浓度
Triton X - 114
2% (w/v)
Tris - HCl (pH 7.5)
50 mmol/L
蛋白酶抑制剂
/
● Buffer A
成分
浓度
RIPA buffer
/
NaCl
0.5 mol/L
● Buffer C
成分
浓度
Tris HCl (pH7.5)
10 mmol/L
NaCl
150 mmol/L
EDTA (pH 7.5)
5 mmol/L
3. 组织膜蛋白的分离方法
实验步骤：
1. 取待裂解组织，加入10 mL Buffer A于冰上充分匀浆。
2. 以800 rpm转速在4 ℃ 下离心10 min后，将所得上清液转移到超速离心管。
3. 以100000 ×g在4℃离心1 h。弃上清，将沉淀用适量的Buffer B重悬，在冰上孵育2 h后分装至EP管，以10000 rpm转速在4 ℃下离心30 min。
4. 收集所得上清液即为膜组分。
所用试剂配方：
● Buffer A
成分
浓度
蔗糖
0.32 mol/L
Tris - HCl (pH 7.5)
5 mmol/L
KCl
120 mmol/L
EDTA
1 mmol/L
PMSF
0.2 mmol/L
Leupeptin
1 μg/mL
Pepstatin A
1 μg/mL
Aprotinin
1 μg/mL
*冰上预冷。
● Buffer B
成分
浓度
HEPES (pH 7.5)
20 mmol/L
甘油
10% (w/v)
Triton X-100
2% (w/v)
EDTA
1 mmol/L
PMSF
0.2 mmol/L
Leupeptin
1 μg/mL
Pepstatin A
1 μg/mL
Aprotinin
1 μg/mL
*冰上预冷。
4. 细菌膜蛋白的分离方法
实验步骤：
1. 在37 ℃ 下过夜培养待裂解细菌，转速设置为200 rpm。
2. 收集细菌细胞，在4℃下以10000 ×g转速离心20 min，弃上清。
3. 用20 mL预冷的Tris - Mg缓冲液悬浮细菌细胞，按步骤2的条件再次离心，再次用预冷的Tris - Mg缓冲液重悬。
4. 超声波破碎细菌细胞。
5. 以3000 ×g转速在室温下离心10 min，去除未破碎的细菌。小心吸取含有胞质成分和细菌外被成分的上清液。
6. 第一次超速离心：100000 ×g，60 min，4 ℃，去除含胞质成分的上清液，收集细菌外被成分。
7. 用10 mL SLS缓冲液重悬沉淀物，室温孵育20 ~ 30 min。
8. 第二次超速离心：70000 ×g，60 min，在室温沉淀，收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复步骤7&8。
9. 用移液器充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1~0.2 mL的水重悬沉淀物。所得该蛋白质样品应在-70℃储存。
所用试剂配方：
● Tris - Mg缓冲液
成分
浓度
Tris - HCl
10 mmol/L
MgCl2
5 mmol/L
*pH调节至 7.3，4℃保存。
● SLS缓冲液
成分
浓度
十二烷基肌氨酸钠（SLS）
2% (w/v)
Tris - Mg 缓冲液
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5. 参考文献
[1] 张建社，褚武英，陈韬，2009，蛋白质分离与纯化技术，军事医学科学出版社
来源：实验老司机
关键词： 蛋白
