光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数（ε）是不相等的，εL≠εR，这会使左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振光，这种现象称为圆二色性（Circular dichroism，缩写为 CD）。根据圆二色光谱法的原理和测试要求设计制成的仪器称为圆二色光谱仪，该仪器广泛应用于蛋白质折叠、蛋白质构象、酶动力学、配位化合物、手性化合物等的科学研究。

 

利用圆二色光谱仪进行分析时，所得结果常以圆二色光谱显示。圆二色光谱中的横坐标是平面偏振光的波长 λ，纵坐标为吸收系数之差（Δε=εL-εR）。由于 εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度 [θ] 与 Δε 的关系为：[θ]=3300Δε，因此圆二色光谱也可以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标作图。

 

圆二色光谱仪的原理

 

光是横电磁波，是一种在各个方向上振动的射线。其电场矢量与磁场矢量相互垂直，且与光波传播方向垂直。由于产生感光作用的主要是电场矢量，一般就将电场矢量作为光波的振动矢量。光波电场矢量与传播方向所组成的平面称为光波的振动面。若此振动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光，其振动面即称为偏振面，如图 1 所示。

 

图 1 平面偏振光产生示意图

 

平面偏振光可分解为振幅、频率相同，旋转方向相反的两圆偏振光，如图 2 所示，圆偏振光的振幅保持不变，而方向周期性变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进。

 

图 2 两圆偏振光示意图

 

其中电矢量以顺时针方向旋转的称为右旋圆偏振光，如图 3 所示。其中以逆时针方向旋转的称为左旋圆偏振光，如图 4 所示。两束振幅、频率相同，旋转方向相反的偏振光也可以合成为一束平面偏振光。如果两束偏振光的振幅不相同，则合成的将是一束椭圆偏振光。

 

图 3 右旋圆偏振光示意图

 

图 4 左旋圆偏振光示意图

 

即能使射入物质的平面偏振光的偏振面旋转的物质称为旋光性物质或光学活性物质，具有手性结构的分子才具有光学活性。

 

圆二色光谱仪的结构

 

圆二色光谱仪主要由氙灯、单色器、光电调节器、样品池以及光电倍增管检测器组成，其结构简示图如图 5 所示。

图 5 圆二色光谱仪的原理图

 

该仪器采用氙灯作光源，光电倍增管作检测器，波长范围 165~850nm，检测范围为 ±3000m°，具有波长可调、光通量大、灵敏度高、数据准确和信噪比高等优势。其中旋光色散附件包含一个可旋转的线偏振分析棱镜，其以 45° 角处在样品和检测器之间来切换垂直和水平光。在圆二色光谱仪的光路上装配旋光色散附件即可进行旋光的测定，从而在手性药物研究中不需使用两种仪器。

 

圆二色光谱仪的图谱

 

我们在引言部分提到了圆二色光谱仪的图谱，即圆二色谱。由于吸收系数之差（Δε）有正值和负值之分，所以圆二色谱也有呈峰的正性圆二色谱和呈谷的负性圆二色谱。在紫外可见光区域测定圆二色谱与旋光谱，其目的是推断有机化合物的构型和构象。

 

如图 6 所示的圆二色谱，其中包含的三种曲线所代表的含义如下所示：

 

当光学活性化合物对光没有特征吸收时，在谱图中仅为一条近似水平的直线；当光学活性化合物对光存在特征吸收时，通常有两种情况：（1）当 εL＞εR 时，得到一个正性的圆二色光谱曲线；（2）当 εL＜εR 时，得到一个负性的圆二色光谱曲线。

 

图 6 圆二色光谱图曲线

 

获取理想的图谱

 

在用圆二色光谱仪对溶液或固体样品进行测试时，我们都想获取理想的 CD 谱图，为了实现这个目的，我们应该注意以下几个方面：

 

手性样品符合 CD 光谱测试的条件（在给定波长范围内有较强的CD信号和合适的吸收值）。必须事先测定手性样品的 UV-Vis 吸收光谱（溶液或固体漫反射），预测 CD 谱峰的可能位置和选择合适的制样浓度（对于溶液吸收光谱，A≈1）。

 

提供高对映纯度的手性样品。

 

根据样品的性质选择测定方式（溶液、固体、单晶或荧光 CD）。

 

对溶液样品应选用合适的溶剂、浓度和光程（与测定 UV-Vis 光谱类似）。对于在紫外区测试的样品建议选用较小的光程（≤0.5cm）和截止波长足够低的溶剂，最好为高纯水或醇类溶剂。

 

对固体样品的压片法测试，应视样品的不同选用合适百分比浓度及合适的稀释剂（KBr、KCl 或 CsI 等）研磨压片后进行透射扫描。

 

选择适当的测定参数（波长范围、扫描速度、灵敏度和狭缝等）。

 

对于同一个样品，在可能的条件下，建议同时做其溶液和固体 CD 光谱加以比较。

 

最好同时做一对对映体的 CD 光谱，以检查其 CD 信号的真伪和在定量的条件下互相印证其对映纯度。

 

圆二色光谱仪的主要优势

 

圆二色光谱仪的主要技术性能优势如下：

 

1.光通量大，特别的光学设计，大大地提高了光通量、光强度，能在全波长范围都可得到很好的信噪比，保证检测数据的真实性。

 

2.灵敏度高，可以检测更细微的结构信息，如带宽可以小至 0.1nm、0.01nm，从而能在检测时得到精确、细微的指纹性结构信息。

 

3.样品（如有机合成物、蛋白样品等）的用量少，可以用很微小的样品池，如光程为 0.01mm（2.6μL）、0.1mm（26μL）的样品池。

 

4.检测器的位置可以调节，在分析脂质体等高光散射类样品时，得到特别大的光通量。

 

5.直接分析温度相关的 CD 光谱信息，从而得到热力学分析信息。

 

圆二色光谱仪的主要应用

 

由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构，而圆二色光谱仪可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化，因此圆二色光谱技术成为生物物理和生物化学研究中的一个非常重要的手段，被广泛应用于有机化学，生物化学，配位化学和药物化学等领域，其主要应用如下。

 

手性结构测定：如官能团的位置及特定原子在手性分子中的位置的测定。

 

构型的测定：利用对应关系和邻近关系测定密切相关的一类化合物的相对构型；利用八区律等一类经验和半经验的规律，结合其它方法测定绝对构型。

 

手性介质（包括溶剂和手性大分子）诱导的光学活性的研究，即一个非手性分子被外部介质所诱导而产生光学活性。

 

溶剂效应：研究溶剂与溶质间的相互作用及该作用对分子的光学活性的影响。

 

圆二色光谱仪还可以用作光谱分析。

 

在分子生物学领域中，蛋白质溶液的圆二色谱可以反映蛋白质的立体结构信息。蛋白质是氨基酸以肽键联接而成的具有特定空间结构的生物大分子，其圆二色性表现为生色基团和折叠结构的总和。

 

张强等人在《中华鳖裙边胶原蛋白的提取、鉴定及其理化性质》一文中利用 Chirascan V100 型圆二色光谱仪对胶原蛋白的微观结构进行分析，实验中将冻干样品溶于 0.05mol/L 的乙酸中，配制成 0.3mg/mL 的胶原蛋白溶液，取少量溶液加入 2mm 比色皿中，放入圆二色光谱仪中，于 25℃，190~250nm 的波长下扫描三次，记录各光谱曲线，结果如图 7 所示。

图 7 裙边酸溶性胶原 ASC 和酶浴性胶原 PSC 在 25℃ 时的圆二色光谱

 

由图中可以看出，在 25 ℃ 下 ASC 和 PSC 的特征圆二色光谱分别在 224nm 和 222nm 处出现正峰，这是左旋聚脯氨酸构型的圆二色谱典型特征，根据结果分析，PSC 的正/负吸收峰比值较 ASC 大，则说明 PSC 比 ASC 的三重螺旋结构更完整。

 

圆二色光谱也常用于研究手性金纳米粒子的微观结构和手性来源，韦克毅等人将手性金纳米粒子的 CD 光谱信号的变化与 Ag+ 的浓度相关联，这种方法既拓展了金纳米粒子的应用范围，又对 Ag+ 的识别与检测提供了新的方法。

 

图 8 和图 9 分别为手性金纳米粒子溶液中加入 10μmol/L Ag+ 后，在 0，0.5，1.0，3.0，4.0，6.0，7.5，10，11，14，15，20 和 25min 时的 CD 光谱以及在 230nm 处 CD 光谱强度的猝灭图。

图 8 手性金纳米粒子溶液加入 Ag+ 后 CD 光谱图

 

从图中可以看出，手性金纳米粒子的 CD 光谱强度随着 Ag+ 的加入迅速下降，最终趋于稳定，稳定时间为 12min，从响应时间的角度考虑，该方法可以应用于 Ag+ 的快速识别与检测 。

 

图 9 CD 光谱强度猝灭图

 

从上述的两个实例中不难看出，圆二色光谱仪对于研究分子结构不对称性、手性结构测定等具有重要作用，在人们的生产生活中扮演着极其重要的角色。

来源：Internet

关键词： 圆二色谱法