1. 前言

 

本文节选自Humana Press于2020年出版的书籍《Experimental Protocols in Biotechnology》，属于Springer Protocols系列， ISBN 978-1-0716-0606-3。

 

文章编译的是其中的第一篇论文《Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Detection of Bacterial Wilt–Causing Ralstonia solanacearum》。

 

在翻译的过程中依据国内实验室习惯人工增加了备注。原文介绍的是使用双抗夹心ELISA对植物样本中的茄科罗尔斯通氏菌进行特异性检测的方法。

 

2. 结果有效性验证

 

1. 定性分析

在孵育约20 min后，观察是否有蓝色出现。阴性和空白对照组肉眼看来应该基本上是清澈的。显色的浓淡程度可用于大致估测微生物载量。在没有分光光度计的情况下，这种定性数据也可用于诊断植物病原体的存在。总而言之就是有蓝色就是阳性有菌。

 

2. 定量分析

使用酶标仪在600 nm波长下测量所有孔的OD值（光密度）。出现蓝色的孔呈阳性结果。加入硫酸作为终止液后，再使用450 nm波长测量观察到的黄色显色。没有显著颜色变化的孔表示阴性结果。只有当阳性对照孔显示阳性结果，且缓冲液或阴性对照孔保持无色时，测试结果才有效。

 

3. ELISA标准曲线的生成与拟合

 

1. 收集标准品R. solanacearum F1C1不同细胞浓度对应的吸光度数据，用以绘制标准曲线：将已知抗原/细菌样品的数量设为x轴，三组重复的吸光度平均值设为y轴。

 

标准曲线对保证定量实验中不同实验组间数据的准确性至关重要，并且每块微孔板都应该单独重复一次以避免因移液误差、孵育、温度和试剂浓度变化引起的差异。空白对照组的数值需从测试值中减去。  

 

2. 基于图中的点绘制最佳拟合曲线。  

 

3. 对于实验中获得的吸光度值，从y轴该数值点作一条水平线延伸至最佳拟合曲线，在交点处作x轴的垂直线，得到x轴上的值（图1）。 

 

图1：标准曲线拟合示例

 

4. 为保证数值准确，细菌抗原的细胞数量或浓度需乘以稀释倍数。  

 

5. 采用棋盘滴定分析法（checkerboard analysis）和较大的样本量（每个样品 4–5 个重复）验证 ELISA 测试，可检测的内容包括以下参数：  

 

a. 检测限度（LoD）：测定方法能够检测到的最低抗原浓度。

 

b. 定量极限（LoC）：能够以可接受的精密度和准确度测量的抗原最高和最低浓度（在此范围内的数据是有效的）。  

 

c. 加标回收率（Spike Recovery）：用于检测稀释溶剂是否会影响测量结果。如果将已知量的抗原加入稀释溶剂中，在后期测量时应该能等量回收；如果无法回收，意味着稀释缓冲液可能与抗原发生了反应。  

 

d. 准确度（Accuracy）：测试结果均值与参考测量值之间的接近程度。  

 

e. 精密度（板内精密度，Intra-assay Precision）：同一样品多次测量之间离散程度的接近性（即技术性重复之间的误差）。板内精密度可以通过 Excel 或 GraphPad Prism 软件、或酶标仪自带的软件，使用标准差（SD）计算获得。  

 

变异系数（CV）或相对标准偏差（RSD）用于计算不同实验间结果的精密度。通常ELISA的CV值不应超过10%，作者在这里认为不应超过15%。  

 

公式：CV = 标准差 / 均值 × 100

 

原作者在此强烈建议进行棋盘滴定分析法计算用于 ELISA 标准化和优化的抗原、一抗和二抗的用量。优势在于尽可能去除背景干扰，节约抗体使用（即使 ELISA 试剂盒中通常推荐较高浓度的抗体），并减少假阳性结果。

 

4 注意事项

 

1. 如需快速检测且对灵敏度要求不高，宜将本方案耗时标准化为4小时。如对灵敏度有需要，可以通过以下方式对方案进行优化：

 

a. 提高抗体浓度

 

b. 延长孵育时间

 

c. 调整孵育温度

 

d. 使用不同浓度的抗原（样品）。

 

*需格外注意确保抗体储存于-20°C或更低温度，并避免反复冻融。

 

2. 注意避免在孵育过程中孔板干燥。可将板放入用湿棉花铺底的盒中保持湿润。  

 

3. 捕获抗体可以回收，并在实验中重复利用至少2次。游离抗体应用螺旋盖管收集，并储存于-20°C。过夜孵育的效果比37°C室温孵育相比更好。可使用3% BSA作为封闭液以避免假阳性结果。  

 

4. 在使用相同二抗的情况下提高检测灵敏度的手段包括：延长孵育时间、提高温度（最高至37°C）以及使用摇床。  

 

5. Ralstonia solanacearum的检测灵敏度取决于样品中的细胞浓度以及所使用的样品类型。上述Ralstonia ELISA检测试剂盒可检测到R. solanacearum的物种级水平，但无法区分小种（race）或生物型（biovar）。

 

此外，该测试也无法区分致病性和非致病性菌株。但一些商业试剂盒提供特定生物型的抗体，请根据ELISA检测的具体实验目的进行选择。

 

6. 上述DAS-ELISA检测的灵敏度极限最低达104至105 CFU/ml的R. solanacearum。该检测方法对植物样品和培养物中的病原体检测最为敏感，但不适用于土壤样品。如需检测土壤中的R. solanacearum，需在富集过程中采用特定的缓冲液配方（如柠檬酸缓冲液）。  

 

7. 过量抗原可能导致“钩子效应”，即抗体不足以结合抗原导致信号减弱。因此，需要对样品进行梯度稀释以预估抗原浓度，确保实验结果可靠。  

 

8. 在读取结果时孔板上如有气泡存在，可能会引起误差，因此在读取前必须去除气泡。在将微孔板放到酶标仪上之前，同样也需确保微孔板底部清洁。  

 

9. 对所有空白对照、标准溶液和测试样品都应做三组技术重复，以便构建准确的标准曲线用于后续统计分析。  

 

10. 注意保持无菌操作。实验过程中操作不到位和样品交叉污染都可能导致对结果的干扰和其他潜在问题。所有塑料器皿和玻璃器皿必须保持清洁。梯度稀释过程中微量移液不准确可能放大误差。  

 

11. 高背景读数可能有以下两种原因：

 

a. 非特异性结合。解决方法是延长封闭时间或更换封闭试剂。封闭剂也可以添加到抗体缓冲液中以减少非特异性结合。

 

b. 通过棋盘滴定法降低一抗浓度，以确定最佳浓度。

来源：实验老司机

关键词： ELISA标准曲线