最近，小编收到甲方工厂QC实验室反馈的问题，原料药某杂质（中性化合物）检测时，方法无法重现（该杂质峰未在规定的等度时间段出峰），而前期该方法已经完成方法转移（前期工作由其他同事完成）。

 

检测该杂质色谱条件如下：流动相（A）磷酸盐（pH7.0），流动相（B）甲醇；洗脱梯度：0-10min，70%A；10.1-18min，70%-20%A；18.1-25min，70%A；色谱柱：Ultimate Xtimate C18；检测波长：254nm；柱温30℃；进样量20µl。

 

甲方QC实验室通过其他同事进行实验，仍然无法重现方法，可能是杂质对照品问题或者色谱柱问题。

 

研发实验室采用性能良好的Ultimate Xtimate C18色谱柱进行方法重现，进样杂质对照品溶液，结果与甲方实验室一致，排除对照品问题，确认是色谱柱问题。

 

图1 性能良好的Ultimate Xtimate C18色谱图

 

研发实验室方法验证时的色谱图（旧的Ultimate Xtimate C18）如下：

 

 

通过上述两张色谱图可以发现，该杂质在相同品牌、规格、型号但批次不一致的色谱柱上的保留时间差异很大，而且该杂质在新色谱柱上的拖尾因子在0.8-1.5之外。查阅旧的Ultimate Xtimate C18（方法验证及方法转移用的同一根）的使用历史，较长时间使用过离子对试剂，该杂质验证的时候拿了该色谱柱进行方法验证及方法转移，应该是离子对试剂导致色谱柱改性，以致方法无法重现。

 

在上述色谱条件下考察色谱柱的耐用性，大多数色谱柱无法重现该方法，在安捷伦ZORBAX SB-AQ C18与Waters Cortecs T3色谱柱上，该杂质峰在等度时间出峰，但峰形差，考虑到工厂QC实验室对该方法的使用，重新进行方法建立。

 

 

备注：筛选色谱柱时，直接通过等度方法查看杂质峰的保留时间。

 

查阅文献，色谱条件如下：流动相（A）磷酸盐（pH8.0），流动相（B）乙腈；洗脱梯度：0-10min，52%A；10.1-18min，52%-20%A；18.1-25min，52%A；色谱柱：Waters Xbridge C18；检测波长：254nm；柱温30℃；进样量20µl。典型色谱图如下：

 

图2 杂质对照品溶液典型图谱

 

 

图3 加标供试品溶液典型图谱

 

图4 加标供试品溶液典型图谱（同品牌、型号、规格但批次不一致色谱柱）

 

后续对新方法进行方法学验证，然后在进行方法转移。

 

建议在方法开发时尽可能用比较新的且性能良好的色谱柱，满足要求就直接用，后续及时采购新的色谱柱进行补充；方法开发的时候，用同品牌规格型号不同批次和不同品牌的色谱柱进行代替，考察色谱柱的耐用性；用过可能改性试剂（如离子对试剂、高盐缓冲液）的色谱柱做好标识，色谱柱台账要及时填写。

 

 

来源：药事纵横

关键词： 色谱柱 杂质检测