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2025中国药典色谱分离新指标峰谷比(p/v)计算方法与应用场景

嘉峪检测网 2025-06-04 08:24

导读:本文对比了峰谷比和分离度的计算公式,分析了分离度和峰谷比的适用场景,提出了制定峰谷比可接受标准的思路,旨在抛砖引玉,供同行借鉴参考。

1.引言


高效液相色谱法中,色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。其中,分离度用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统分离效能的关键指标[1]。


2025药典增加了峰谷比(p/v)作为衡量色谱系统分离效能的新指标,与USP、EP药典系统适用性要求保持一致[1,2,3,4]。这一变化不仅仅是为色谱分离效能的评估提供一种新的选择,关键在于提升了色谱分离效能评价的科学性。


本文对比了峰谷比和分离度的计算公式,分析了分离度和峰谷比的适用场景,提出了制定峰谷比可接受标准的思路,旨在抛砖引玉,供同行借鉴参考。

 

2.峰谷比和分离度的计算公式:


峰谷比和分离度作为色谱分离效能的评价指标,两者在计算公式上有较大差异,见下表:

分类

峰谷比

分离度

 

 

 

计算

公式

式中:Hp为小峰平行外推基线的高度;Hv为小峰和大峰间曲线最低点平行外推基线的高度。

公式1:

 

或公式2:

式中:tR2为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间;tR1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间;W1、W2及Wh/2,1、Wh/2,2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽。

注:当对测定结果有异议时,分离度应以半高峰宽(Wh/2)的计算结果为准。

示意图

 

 


 

 

说明

峰谷比越大,分离效能越好

分离度越大,分离效能越好

 

3.峰谷比和分离度的适用场景


分离度的计算是基于保留时间和峰宽,因此其计算数值容易受到峰宽的影响,对于异常峰或峰形不对称时(如肩峰、拖尾峰、前沿峰),分离度的计算可能失真,因此分离度更适合评估基线分离时的整体效果。


峰谷比的计算是基于两相邻峰中小峰的峰高和两峰间峰谷的高度比,因此更适用于待测物质峰与相邻峰之间未达到基线分离时的情形,此时峰谷比相比分离度,能更真实反映分离状态。


SzabolcsFekete等人在研究SEC色谱分离时提出,分离度通常不适用于重叠峰和不对称峰,且特别不适用于高度差异很大的部分分离峰,但峰高差异较大的情况在 SEC 中经常出现,因此,为了克服分离度的局限性,SEC 中通常考虑峰谷比。[5]


EvaTyteca等人在进行色谱响应函数(CRF)的研究中发现,基于峰谷比的CRF比基于分离度的CRF能更好地应对峰不对称。然而,一旦噪声水平变得显著,峰谷比就失去了优势。[6]


综上:当达到基线分离时,采用分离度作为评价指标较为合适。当未达到基线分离时,且两峰差异过大或峰拖尾时,采用峰谷比作为评价指标更科学。但当基线噪音较大时,采用峰谷比作为评价指标将导致可靠性下降,此时应选用分离度。

 

4.如何制定峰谷比的可接受标准


相较于分离度的基本要求“除另有规定外,待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5”,各国药典的《高效液相色谱法》中并没有对峰谷比提出模式化的统一标准。


那么,当分离度无法真实反映实际分离效能时,企业应当如何合理制定峰谷比的可接受标准呢?下表列举了从中国药典以及EP药典中随机摘录的一些典型实例[1,3]:

来源

品名

峰谷比要求

Chp2020

阿卡波糖

杂质I 的峰高与杂质I 和阿卡波糖两峰之间的峰谷比不得低于2. 0

富马酸福莫特罗

福莫特罗峰与非对映异构体峰,两者的峰谷比应不低于2. 5

培哚普利叔丁胺

杂质Il 峰的峰高与杂质ll 峰和培哚普利叔丁胺峰之间的峰谷比应大于3

EP11

阿卡波糖

杂质A 的峰高与杂质A 和阿卡波糖两峰之间的峰谷比不得低于1.2。

醋酸氯地孕酮

杂质E 的峰高与杂质E和醋酸氯地孕酮两峰之间的峰谷比不得低于1.6

硫酸阿巴卡韦

杂质D的峰高与杂质D和阿巴卡韦两峰之间的峰谷比不得低于3. 0

阿法骨化醇

杂质A 的峰高与杂质A 和阿法骨化醇两峰之间的峰谷比不得低于5.0;

杂质D的峰高与杂质D和杂质A两峰之间的峰谷比不得低于1.5

阿西美辛

杂质B 的峰高与杂质B和阿西美辛两峰之间的峰谷比不得低于15

 

从上表可以看出,峰谷比的可接受标准几乎是“天差地别、五花八门”。


因此,企业可依据具体品种的具体检测项目、实际检测条件以及分析方法开发的知识空间,拟定科学合理的标准,即:在分析方法的耐用性空间中,找到一个最差的分离条件,采用此条件进行方法学验证(准确度、精密度、线性等),各项验证均满足拟定的验证要求时,那么此条件下的峰谷比即为可接受的最低标准。


值得注意的是,依据分析方法开发的先验知识,若分析方法的关键分离峰不止一对(即:仅制定两峰间的分离评价指标,无法代表整体的分离效能)时,应将所有的“关键分离峰”纳入系统适用性要求,以保证通过系统适用性试验的检测条件始终具备通过验证时的性能,确保检测结果的准确、可靠。

 

参考文献:

[1]Chp2020

[2]USP43

[3]EP11

[4]Chp2025

[5]Quantitative description of the quality of size exclusion chromatography separations

[6]A universal comparison study of chromatographic response functions

 

 

来源:注册圈

关键词: 色谱分离

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