氨基酸是构成蛋白质的基本单位，对于生命活动至关重要。因此，氨基酸检测在生物、医学、农业和食品等领域具有广泛的应用。

现有的氨基酸分析技术有高效液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法和离子交换色谱法。一般液相色谱或气相色谱需进行衍生化方可进样分析，LC与GC经常与质谱（MS）联用对氨基酸进行分析，一般无需进行衍生处理。其中柱前衍生液相色谱法应用较多，且有很多柱前衍生试剂， 如荧光胺(FA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亚胺基甲酸酯(AQC) 、氯甲酸芴甲酯(FMOC-CI) 、丹磺酰氯(Dansyl-CI) 、邻苯二甲醛(OPA)、和2, 4-二硝基氟苯(DNFB)等。阳离子交换色谱法是基于氨基酸在酸性条件下变成阳离子并经阳离子交换色谱柱分离后，再与茚三酮发生衍生化反应，产生能被紫外-可见光检测的紫色或深蓝色或黄色衍生物。本文主要介绍衍生化反应对氨基酸分析的应用。

 

柱前衍生高效液相色谱法

由于氨基酸多数没有紫外吸收，故需要经过衍生化后产生紫外吸收。

在进行色谱分离之前，需要对样品进行适当处理。如固体样品需要进行粉碎、混合和均匀化；液体样品需要稀释到适当的浓度，以适应色谱分离的需要。同时，需要消除样品中的杂质和干扰物质，以提高检测的准确性和可靠性。

荧光胺(FA)、异硫氰酸苯酯(PITC)等生化试剂能够与氨基酸发生反应，在原有氨基酸结构基础上引入其他基团，使氨基酸存在紫外或荧光吸收并且增加其极性和亲水性，使其更适合在反相色谱柱上分离。此外，衍生化反应需要控制温度、pH值等，以保证反应的正常进行。

 

图1：PITC与氨基酸反应方程式

 

衍生化后的产物经过液相色谱梯度洗脱（常用的色谱柱填料包括硅胶、C18、C8等反相色谱柱填料，流动相一般为水-有机溶剂的混合物），即可产生相应的峰，且灵敏度较高，可以实现对氨基酸高效、准确和高灵敏度的分析，为氨基酸相关研究提供有力支持。

 

图2：液相色谱柱前衍生氨基酸测定色谱图（PITC与氨基酸反应后进样）

 

柱后衍生色谱法

柱后衍生是指将经过色谱分离后的氨基酸与适当的衍生化试剂加热，转化为适合检测的形式，以提高检测的灵敏度和选择性。常用的衍生试剂有茚三酮、邻苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯等。

氨基酸分析仪利用经典的茚三酮柱后衍生法来分析水解蛋白和生理液中的氨基酸，可对目前关注的所有氨基酸进行定性定量检测。氨基酸分析仪所使用的是阳离子交换色谱-柱后茚三酮衍生的方法对氨基酸进行分析，注射的样品经阳离子分离柱分离后，与持续进入系统的茚三酮混合衍生后，经紫外检测器检测出信号出峰。

氨基酸分析仪所使用的是Na+型(或Li+型)磺酸基强酸性阳离子交换树脂。氨基酸离子和强酸性活性基团（－SO3-）之间的相互作用。由于氨基酸为两性电解质,在酸性条件下呈+H2N-CHRCOOH状态，能被树脂表面的活性基团（－SO3-）吸附，通过淋洗液pH的变化使氨基酸被逐一淋洗下来。酸性氨基酸与活性基团亲和力最弱最先被淋洗下来，其次是羟基氨基酸和中性氨基酸，然后是芳香族氨基酸，碱性氨基酸最后被淋洗出来。Na+型树脂一般用于蛋白质水解液中的氨基酸分析，Li+型树脂一般用于生理体液中的氨基酸分析。Na+型树脂一般可用于18种氨基酸的测定，Li+型树脂一般可用于34种氨基酸的分析测定。

伯氨型氨基酸在与茚三酮反应的过程中，会发生氧化反应，从而脱去氨基和羧基，转化为相应的醛。同时，茚三酮在这一过程中被还原为还原茚三酮。随后，这种还原茚三酮与另一个茚三酮以及氨发生反应，生成一种蓝紫色物质，其最大吸收波长为570nm。

 

图3 伯氨型氨基酸与茚三酮反应

 

仲氨型氨基酸，如脯氨酸和羟基脯氨酸等，在与茚三酮反应时，并不会释放NH3，而是直接生成黄色的化合物。这种化合物的最大吸收波长在400nm，二级最大吸收在440nm（由于440nm波长的能量更为稳定，因此最终选择该波长）。反应后的混合物流入双通道光度计，通过双波长(570 nm和440 nm) 同时连续测量。

 

图4 仲氨型氨基酸与茚三酮反应

 

图5 氨基酸分析仪柱后衍生氨基酸测定色谱图

 

经过对比氨基酸分析仪与液相色谱方法，发现两者的灵敏度相当，但在分析时间上，氨基酸分析仪相对较长。虽然氨基酸分析仪和液相色谱仪都能实现基线分离，但氨基酸分析仪的价格较高，并且所需的试剂纯度要求也较高，特别是茚三酮这种试剂价格昂贵，且在市场上较难获得。与此相反，液相色谱仪更为普遍，而氨基酸分析仪仅限于氨基酸分析，导致其实用性相对较差。因此，目前氨基酸测定的主流方法是液相色谱柱前衍生，而氨基酸分析仪的使用则相对较少。

 

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关键词： 氨基酸