食用油能够提供维持人体生命所需的能量以及多种脂肪酸（FAs），合理科学摄入食用油，能够有效预防心脑血管、阿尔茨海默病等。近年来，随着人们生活水平的提高，食用油品质的安全性越来越受到人们的关注。FAs是指一端含有一个羧基的长链脂肪族碳氢化合物，是油脂检验常见的目标物，在生物体的构成与生命活动中发挥了重要作用，常见的FAs有硬脂酸、花生四烯酸和豆蔻酸等。FAs种类与含量的差异是分析油脂的关键依据。

 油脂检验对食品安全犯罪案件的侦查和打击意义深远，因此建立准确、快速、有效的FAs检测方法十分重要。目前常见的分析方法有光谱法、电化学法、色谱法、核磁共振波谱法以及质谱法。其中，核磁共振波谱法与光谱法快速无损，无需复杂的前处理过程，在研究不同种类油脂的分类中应用广泛，但对各组分难以实现准确定量；电化学法灵敏，且响应时间短，但受限于电极，在检测中往往存在干扰；质谱法因其灵敏度高、稳定性好等优势，在 FAs的定性定量分析中地位显著，是油脂检验的黄金方法。

研究人员重点对近年来基于质谱法检测FAs的先进衍生化方法进行了综述，并提出了质谱检测中衍生化方法进一步发展的方向，以期为侦查实践提供参考依据。

 

Part.01脂肪酸质谱分析概述

近年来，质谱分析凭借检测灵敏度和选择性的优势，成为检测FAs最成熟的分析技术。质谱分析可以确定FAs的类型、含量和组成等信息，在食品、生物医学领域应用广泛。对食品中 FAs 的分析，能够评估食品的营养价值、品质、真伪；在生物医学领域，FAs作为生物体中重要的能量来源和生理活性分子，其代谢异常与多种疾病的发生和发展密切相关，针对其进行代谢研究，有助于疾病模型的构建，可为疾病的诊断与治疗提供思路。FAs质谱分析分为直接质谱分析和衍生化-质谱分析两种方法。

直接质谱分析无需样品预处理和衍生化等步骤，响应时间短。近年来，环境离子化质谱分析发展迅速，可将样品经简单的溶剂提取或者直接表面分析后，通过离子化技术产生离子进行质谱分析，可对样品进行原位质谱分析，适用于食品或生物样本中痕量FAs的分析，是目前较成熟的直接质谱分析技术。环境离子化质谱分析不断进步，已能够满足高通量检测的需要。ESPINOZA等对海龟组织中的油脂进行提取，结合实时离子源直接分析与飞行时间质谱联用法（DART-TOF）测定6种不同品种海龟油脂，共得到13种FAs，依据组成和含量差异实现了6种海龟油的区分。该方法与常规的色谱-质谱法相比，省去了衍生化过程，为海龟油的快速识别提供了可能。CORDEIRO等采用解吸电喷雾质谱法（DESI-MS）对未成熟卵母细胞与经体外培养后的卵母细胞中9种FAs、16种甘油三酯和磷脂、固醇等其他脂质成分进行分析，并通过主成分分析实现了两种卵母细胞的区分，为细胞动态差异的研究提供了思路。然而，环境离子化质谱技术的分辨率相对较低，无法对复杂样品中的各种成分进行区分。

化学衍生化-质谱分析是一种广泛应用于色谱-质谱联用分析的方法，基于衍生化质谱检测FAs的工作流程如图 1所示。它通过对FAs进行化学衍生化反应，增强离子化效率和选择性，从而提高检测灵敏度和准确度。该方法既可实现已知目标物的靶向检测，也可以用于未知目标物的非靶向检测。气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）和毛细管电泳-质谱法（CE-MS）等检测平台提供的结构信息有助于区分FAs异构体、发现新的FAs，方法灵敏度高，可以达到nmol·L−1级别。此外，质谱成像（MSI）通过从生物组织获取多点质谱数据来提供分子分布信息，基质辅助激光解吸电离（MALDI）或解吸电喷雾电离（DESI）与MSI联用检测FAs，在探究组织水平的空间分布上具有显著优势，空间分辨率和分析灵敏度高，可以在不破坏生物组织的情况下对生物样本的空间分布和化学变化进行高精度分析，在研究生物体内FAs代谢的过程中具有广阔前景。

 

 

Part.02衍生化在质谱分析FAs成分与含量中的应用

GC-MS、LC-MS、CE-MS和 MSI的快速发展为食物和生物样品中 FAs的检测提供了快速和准确的方法。高分辨质谱的应用扩展了FAs的检测范围，但FAs电离效率低，难以直接通过质谱进行检测。在基于质谱的分析中，衍生化FAs是一种有效的策略，可以增加FAs的挥发性，提高电离效率并减少基质效应。目前常见的衍生化方法有硅酰化、烷基化和酰基化等。由于不同类型的FAs及其衍生物涉及不同的理化性质，几乎不可能对所有类型的FAs制定一种在所有情况下都最优的衍生化方法。因此，应根据研究目的、样品性质和所选仪器方法等因素选择衍生化方法。

2.1 气相色谱-质谱法

GC-MS是分析复杂基质中挥发性化合物的常用方法。然而，大多数FAs沸点较高，不易挥发，在高温条件下不稳定，直接采用气相色谱柱程序升温的方法无法对FAs起到良好的分离效果，因此需要对FAs进行衍生化处理。

基于GC-MS的衍生化方法可分为甲酯化和硅烷化两类。甲酯化可大致分为酸催化法与碱催化法，其中盐酸、硫酸、乙酰氯、三氟化硼等均是常见的酸性衍生化试剂；碱催化法常用试剂有氢氧化钾、四甲基氢氧化铵（TMAH）等，在食品和生物样本的FAs检测中应用广泛。CHEN等建立了衍生化-GC-MS分析牛乳中FAs的方法，于50℃碱催化20min时甲酯化效率最高，以 GC-MS对50份牛乳样品进行定量分析，检出限为 0.009~0.169mg·L− 1；YUENYONG等制备了50种冷压植物油，将0.015g油样与0.20mL甲苯、1.50mL甲醇、0.30mL的8.0%（体积分数）盐酸溶液混合，采用酸催化法进行衍生，测得50种植物油中单不饱和 FAs的质量分数为10.17%~80.25%，多不饱和FAs的质量分数为0~78.25%，采用主成分分析与方差分析对50种植物油进行差异分析，依据FAs组成及含量差异对所制备油脂进行分类。

硅烷化常用试剂有N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）以及 N-甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA）等。PLEIK等利用MSTFA衍生指纹中的FAs，采用GC-MS研究指纹残存物中不饱和 FAs 的成分，检出6-十六碳烯酸和8-十八碳烯酸等，可为利用指纹中 FAs成分进行个体溯源的研究提供参考。MOON等使用MTBSTFA衍生，采用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）对人体唾液中18种FAs进行分析，18种FAs的总体回收率为73.8%~114%，准确率高达99.3%，为临床诊断以及法庭科学领域嫌疑人识别提供了新思路。

2.2 液相色谱-质谱法

LC-MS适用于强极性以及弱挥发性物质的检测，理论上可无需衍生化便可以对FAs进行直接分析。HELLMUTH 等尝试使用LC-MS直接检测FAs，以减少衍生过程中潜在的污染，但该方法检测灵敏度有限，无法使不饱和FAs的反式和顺式异构体相互分离。

电喷雾电离（ESI）常用于 LC-MS的分析过程，由于电喷雾液滴中携带大量负电荷，抑制FAs中羧基负离子的形成，导致FAs离子化效率低，质谱检测信号差。衍生化FAs引入正电荷，可避免酸性流动相的离子抑制，提高电离效率和检测灵敏度，是当前基于LC-MS检验FAs的主要衍生化思路。常用衍生化试剂包含N、S等MS响应高的元素，如N-（4-氨甲基苯基）吡啶盐（AMPP）、N，N-二乙基乙二胺（DEEA）、2-吡啶甲胺（2-PA） 等，在食品与生物样本中应用广泛，反应原理如图2所示。在样品制备过程中加入衍生化试剂，能有效提高LC-MS 分析FAs的灵敏度。JAOCHICO等提出了液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测人类血浆和尿液中短链脂肪酸（SCFA）的方法，在 23℃下使用10μL1mol·L−13-乙基碳二亚胺盐酸 盐（EDC）和1mol·L−1O-苄 基 羟 胺（O-BHA）的混合液对FAs 进行衍生化处理，使用C18超高效反相液相色谱柱，以0.1%（体积分数）甲酸溶液-乙醇体系为流动相，采用梯度洗脱程序，在5.5min内实现了良好的基线分离，提升了SCFA衍生产物定量检测的特异性和灵敏度。YANG等采用 2-溴-1-甲基碘化吡啶和3-甲醇-1-甲基碘化吡啶衍生，生成3-酰基氧基甲基 -1-甲基碘化吡啶（AMMP），采用LC-ESI-MS以正离子模式定量分析 FAs，检出限为1.0~4.0nmol·L−1，检测灵敏度比负离子模式下未经衍生化分析FAs的方法提高2500倍。JIANG等以 5-（二甲氨基）萘-1-磺酰基哌嗪（Dns-PP）和（二乙氨基）萘-1-磺酰基哌嗪（Dens-PP）两种结构类似的衍生化试剂，建立了LC-MS/MS定量检测血清样品中游离FAs的高覆盖率方法，将检测灵敏度提高了50~1500 倍。

 

 

2.3 毛细管电泳-质谱法

毛细管电泳（CE）是一种强大的液相分离技术，可用于分离不同种类的化合物。然而，由于CE本身无法确定未知化合物，因此常结合质谱技术使用。质谱技术可以通过分析化合物的质荷比（m/z）提供定性信息，并具备检测低浓度水平目标物所需的灵敏度。在毛细管区带电泳（CZE）中，选择性由溶液中的m/z 驱动。而衍生化可以同时改变分析物的电荷或质量，从而影响其迁移速率并实现选择性调整。

由于FAs本身只能通过负离子模式进行分析，因此采用了与LC-MS相似的衍生化机理，即利用带正电荷的试剂对羧基进行化学修饰，在目标物中引入正电荷，提高电离效率，从而提升检测灵敏度。AZAB等开发了一种采用多段注射进样的非水性CE-MS分析人体血浆中20余种游离FAs的方法，试验结果与GC-MS进行比较，实现了相互印证，表明该方法检测血清血浆中的FAs具有出色的准确度和精密度。

LEE等采用1，5-戊二基双（1-丁基吡咯烷）二氟化物与饱和FAs形成络合物，有效弥补了传统方法对SCFA响应差的不足，结合CE-MS对奶酪和咖啡样品中15种饱和FAs进行测定，检出限为0.13~2.88mg·L−1，为食品营养价值的评估提供了新方法。KOK等证明了CE-MS有效分离和灵敏检测各种 FAs的超高潜力，采用质谱正电离模式检测FAs，在2mol·L−1乙酸溶液、45%（体积分数）乙腈溶液作为背景电解质下，用2-甲基吡啶胺或DEEA衍生化FAs时，实现了最佳的分离效果，检出限为25~250nmol·L−1。

2.4 质谱成像平台

MSI可以通过分子m/z实现生物分子的空间分布可视化，常用于分析各种生物样本中的物质。在MSI分析中经常使用 MALDI与DESI源。

FAs的相对分子质量（100~400）低，电离效率差，在生物样本中响应低，因此应用MSI直接对FAs检测效果较差。基于MSI方法的衍生化试剂主要集中于提升FAs的电离效率，以提升检测灵敏度。WU等以2-PA作为液相衍生剂，通过MALDI-MSI对衍生化后的 FAs进行分析，成功检测到9种FAs，包括7种不饱和长链脂肪酸（LCFAs）（二十二碳六烯酸、花生四烯酸、油酸等）和2种饱和LCFAs（硬脂酸和棕榈酸）。与气枪吹入衍生试剂法相比，电喷雾法的灵敏度提高了3倍。与2-PA衍生物相比，将N，N-二甲基哌嗪碘化物（DMPI）引入 FAs 获得了更高的MS 响应和更广泛的 LCFAs 覆盖。由于游离 FAs 的衍生化过程不影响对磷脂的检测，两种分析物均可在生物样本中同时检测和成像。

与其他基于质谱的分析方法相比，MSI最独特的优势在于它能够提供代谢物的空间分布信息，空间分辨率高，在代谢与脂质组学研究中优势明显，对同分异构体的区分以及官能团位置的确定具有显著优势，未来应用前景明朗。然而，MSI对采样要求以及化学覆盖率有较高的要求，并且仪器成本高昂，主要应用集中在FAs结构解析以及脂质分布情况的探索中，同其他质谱分析方法相比，在FAs定量分析中应用相对较少。

 

表1中列出了不同质谱分析FAs的衍生化方法

 

样品	衍生化试剂	分析方法	色谱柱	检出限	文献
食用油	DEEA	ESI-MS/MS		0.1~0.3 nmol·L−1−1	[22]
人体唾液	MTBSTFA	GC-MS/MS	MXT-5	0.01~0.5 mg·L−1−1	[26]
血清	Dns-PP和Dens-PP	LC-MS/MS	XDB-C1818​	2~20 nmol·L−1−1	[34]
细胞培养基	AMPP	CE-MS	多孔尖端毛细管柱(91 cm × 30 μm)	25~250 nmol·L−1−1	[39]
大脑组织	2-PA	MALDI-MSI			[42]
血清	N,NN,N-二甲基乙二胺	LC-MS(全扫描,ESI)	RP	1.1~6.8 mmol·L−1−1	[43]
大鼠血浆	H22​SO44​-CH33​OH	GC-MS	DB-WAX	0.5 mg·L−1−1	[44]
食用植物油	KOH-CH33​OH	GC-MS	HP-18	10~20 μg·g−1−1	[45]
人体血液	BF33​-CH33​OH	GC-MS	SLB-H.60	0.59 μg·g−1−1	[46]
人体血浆	CH33​COCl-CH33​OH	GC-MS	DB-WAX	0.63~9.55 μmol·L−1−1	[47]
老鼠粪便	五氟苯基溴	GC-MS	DB-225与DB-5相连	0.244~0.977 μmol·L−1−1	[48]
米糠油	TMAH	GC-MS	DB-17	0.02~0.12 μg·g−1−1	[49]
种植人参	[dbb​]/[d1010​]-双(吡啶)碘四氟化硼	激光烧蚀碳纤维电离-质谱成像法(LACFI-MSI)			[50]
大鼠粪便与血清	2-硝基苯肼	DART-MS		1~24 μmol·L−1−1	[51]

 

Part.03衍生化在质谱分析脂肪酸结构中的应用

不饱和FAs是磷脂、甘油三酯和其他脂质的重要组成部分，n‐3和n‐6多不饱和脂肪酸（PUFA）也是前列腺素和脂质等重要信号分子的前体物质，这些不饱和FAs结构的多样性主要源于不同的链长、不饱和程度和脂肪链中的碳碳双键（C=C）位置、几何结构等多重结构特征。FAs的电离效率低，直接用质谱分析区分同分异构体往往比较困难。目前，FAs质谱分析技术在食品安全、生物医学以及代谢组学领域发挥着重要的作用。传统的质谱检测FAs基于靶向检测的原理，侧重对已知FAs种类与含量的分析，对分析物的检测覆盖范围小，难以实现大规模非靶向筛查研究。研究人员正尝试进行多次试验（如二维色谱 -质谱分析）来增加更广泛的分析物覆盖范围，OLFERT等开发了一种使用紫外光电二极管阵列检测器（UV-DAD）与四极杆飞行时间质谱（QTOF-MS/MS）检测器检测的全二维液相色谱方法，用于分离共轭PUFA 异构体和结构相关的化合物，直链淀粉基手性固定相（一维）用于分离不同的异构体，反相C18柱（二维）用于区分双键数与氧化程度，为PUFA双键位置异构以及未知FAs的结构研究提供借鉴。然而，该方法对于丰度低、电离效率差的代谢物，仍然难以监测。

由于PUFA的重要价值，近年来通过衍生化结合质谱技术进行精确的结构鉴定，特别是碳碳双键定位，受到越来越多的关注。目前，研究人员不断研制新的化学衍生化方法，包括P-B反应、臭氧诱导解离（OzID）、紫外线光解离（UVPD）和环氧化反应等，通过与C=C不同位置结合生成异构体特异性识别指示物，实现精确的结构鉴定。MURPHY等开发了基于丙酮的P-B反应衍生化方法，与碰撞诱导解离（CID）的质谱方法联用，使用 [d0]/[d6]-丙酮混合物作为C=C识别指示物，对含4个及以上C=C的PUFA 实现了碳碳双键位置的确定；SUN等以 3-苯甲酰基吡啶作为新型衍生化试剂，能够在紫外光或可见光照射下与C=C 反 应，结合MALDI-MSI可以在大鼠大脑不同区域对脂质的C=C位置异构体进行成像，为组织脂质组学提供了一种准确和可视化的研究方法；NARREDDULA 等将一种光不稳定的芳香碘化物与AMPP结合，通过质谱仪的激光照射激活生成两种吡啶固定电荷衍生剂（4-I-AMPP 和 3-I- AMPP），用于LC-MS检测 FAs。衍生后的FAs碳碳键的自由基定向解离，使FAs的结构研究和不饱和键或位置异构体的区分成为可能；ZHANG等开发了一种N-甲苯磺酰胺化衍生方法，对人类甲状腺组织和肿瘤组织进行定性和定量研究，该衍生化方法特异性强、效率高（15s内即可完成），结合串联质谱法能够特异地确定C=C的数量和位置，发现肿瘤组织中不饱和 FAs 的总含量增加，为疾病模型的FAs共轭异构研究提供了新方法。近年来，基于同位素标记的衍生化方法通过比较轻、重衍生物的准确质谱和质谱 / 质谱信息过滤出目标物，选择m/z差值一致的离子进行进一步鉴定，在FAs结构分析与定量分析方面具有巨大潜力。LU等选择 [d0]/[d10]-双（吡啶）碘四氟化硼试剂对人参活性代谢物的C=C进行衍生化，能够靶向识别C=C，特异性强，灵敏度高；ZHENG等合成了一对同位素标记试剂4-氨基-N-甲基苄胺（4-AMBA）和AMBA-d5，建立了稳定同位素标记-超高效液相色谱-ESI-MS/MS 检测34种SCFA的方法。 试 验结果表明，衍生化处理明显提高了检测灵敏度，与未标记的SCFA相比，大多数FAs的检测灵敏度提高了3个数量级。

衍生化有效提高了FAs检测的灵敏度与覆盖范围，在特征结构信息的探索方面展现出显著的优势，基于化学衍生化的脂质组学方法已成为分析复杂生物样品中脂质组的可靠技术。因此，针对衍生化方法的开发与研究，在FAs的结构探索与含量分析中意义重大，能够有效推动质谱分析FAs方法的优化与进步。

 

Part.04总结与展望

研究人员综述了质谱检测FAs的衍生化方法的应用研究进展，并总结了在不同质谱检测平台上的衍生化原理与应用。对FAs进行衍生化前处理是提高色谱性能、检测灵敏度、选择性和定量精度的有效方法。衍生化与质谱检测技术的结合，借助质谱的高分辨率，显著扩大了FAs的检测范围。根据不同的质谱检测方法，制定对应的衍生化策略对 FAs的分析至关重要。此外，针对FAs的分析不仅仅局限于食品范围的油脂检验，在生物样本中的应用同样广泛，如血浆、粪便、尿液、肝脏等。对其FAs成分、含量和结构进行定性定量分析，有助于区分、识别样本来源，为公安机关打击犯罪提供指导。

衍生化在质谱分析 FAs 的方法中被广泛应用，衍生化能够提高目标物的挥发性、电离效率，并减少基质效应，有助于研究人员对FAs结构进行推断。结合GC-MS分析时，通常采用甲酯化和硅烷化等衍生化方法使目标物的沸点降低、挥发性增强；与GC-MS不同的是，LC-MS和CE-MS不受样品挥发性影响，因此具有更高的分辨率和灵敏度；此外，MSI还可以提供可视化的结构信息。目前主流的衍生化方法是引入正电荷改善FAs的电离效率。

虽然衍生化处理为质谱分析带来了很多便利，但它也存在一些问题，如时间耗费较长，同时衍生化过程中还会产生一些副产物，这些都可能影响检验的准确度。同位素标记衍生化试剂的开发与引入，有助于实现复杂基质中FAs的定量以及生物样本中FAs的覆盖深度。为了满足法庭科学领域对复杂、痕量样品的检验以及非靶向筛查的需要，需要开发选择性好、反应效率高的新型衍生化试剂，以实现绿色化学的需要，简化反应步骤并提高反应效率和稳定性。

质谱分析朝向高分辨率发展已经成为必然趋势。面对庞大的分析数据，研究人员运用数学模型优化试验条件，缩短时间并提高效率。基于FAs结构与含量信息，改进基于深度学习的分类识别算法能够使研究人员更准确地对油脂进行分类，使分析结果更加高效、直观。同位素标记化学修饰法与计算代谢物鉴定相结合可能是未来新化合物鉴定的有效方法，有望对于 FAs的结构分析产生推动作用。

 

 

来源：Internet

关键词： 衍生化 脂肪酸