摘要

目的：全面梳理寡核苷酸药物的基本情况及其质控手段（尤其是有关物质分析技术），为更为精准的控制寡核苷酸药物的产品质量提供参考。

方法：通过检索国内外相关文献及数据库，对寡核苷酸药物的杂质种类、创新色谱法和质谱法等在寡核苷酸杂质分析、结构表征、精准定量等方面的研究进展进行整理、分析和归纳。

结果：已上市的寡核苷酸药物主要有3类，质量控制主要参考国外相关指南，离子对反相色谱法、离子交换色谱法和质谱法常用于寡核苷酸药物质量控制，同时其他分析技术具有独特优势。

结论：寡核苷酸质量控制取得了很大进展，但在国内缺少针对性指导原则。另外，现有寡核苷酸药物分析方法仍存在一些问题。需深入研究，开发新方法，为寡核苷酸药物质量控制提供技术支撑。

 

关键词

寡核苷酸；反义寡核苷酸；小干扰核糖核酸；核酸适配体；质量控制；有关物质；液相色谱法；质谱法；液质联用

 

核酸是生命体发挥生命活动必不可少的组成物质。目前，已证明有明确靶点的疾病许多都与核酸的错误表达有关。随着现代DNA/RNA合成技术以及生物学手段的不断进步，尤其是新冠mRNA疫苗的成功应用，证明了开发以核酸结构为基础治疗和预防疾病的药物，正在成为未来人类解决尚未被满足临床需求问题的重要方向。

寡核苷酸是核酸药物的重要组成之一。其由嘌呤或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸基组成的短线聚合物，被认为是继小分子药物、蛋白药物和抗体药物之后的新一代药物，被视为生物医学前沿领域最具有前途的药物。与传统的小分子药物相比，寡核苷酸药物具有高特异性、高效和长效的优势，可以在基因层面上调控被传统小分子药物认为“无成药性”的蛋白质的表达，应用范围广。

尽管寡核苷酸药物的发展势头迅猛，但是其质量控制方面仍存在一系列亟待解决的科学问题。为了促进寡核苷酸药物质量的全面提升，亟需开发先进的分析方法，实现寡核苷酸的精准质控。本文将介绍寡核苷酸药物的种类，对寡核苷酸药物的国内外指南情况、寡核苷酸药物的化学修饰和递送策略以及其质控中主要关注的杂质类型进行综述，并总结了近年来色谱法、质谱法（MS）以及液质联用技术（LC-MS）在寡核苷酸药物有关物质研究中的应用进展。

 

1寡核苷酸药物的种类

截止今年（2024年）上半年，已有20种寡核苷酸药物在国外获批上市（表1），包括反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide, ASO）、小干扰核糖核酸（Small Interfering RNA, siRNA）和核酸适配体（Aptamer）。

注：1 GalNAc.N-乙酰半乳糖胺；2 LNP.脂质纳米颗粒；3 PEG.聚乙二醇

Note: 1GalNAc. N-acetylgalactosamine; 2LNP. Lipid Nanoparticle; 3PEG. Polyethylene glycol

1.1 ASO

ASO是一种合成的、含13~30个核苷酸、具有多种化学性质的单链聚合物，可以结合与之互补的RNA靶点。当ASO与互补RNA结合之后，主要通过RNA降解机制和空间为主机制2种发挥作用（图1）。

1.2 siRNA

siRNA是一种含有约20~30个碱基对的双链RNA，其中1条链称为引导链，也叫反义链，具有药理活性；另1条链称为随从链，也叫正义链。siRNA主要通过RNA干扰（RNAi）机制起作用（图1）。

1.3 Aptamer

Aptamer是约含有20~100个核苷酸的单链DNA或RNA分子。Aptamer的作用机制不同于ASO和siRNA（图1），不依赖于碱基配对原则，而是依靠独特的空间结构特异性识别金属离子、蛋白和细胞，具有很高的亲和力。

1.4 微小核糖核酸（microRNA，miRNA）

miRNA是含有大约18~25个核苷酸的非编码RNA分子，可以与序列互补的mRNA结合，导致翻译后的抑制、降解和沉默，其失调会导致一些疾病的发生。miRNA的作用机制也是RNAi机制，但相对于外源性设计的siRNA，miRNA是内源性产生的，无法分配给他们特定的沉默任务，易引起不良反应。目前尚未有miRNA药物上市。

 

2国内外寡核苷酸药物质量控制的指南

寡核苷酸药物的结构、性质与小分子化学药品有较大差异。因此，现有的与质量控制相关的人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）指导原则[Q3A（R2）、Q3B、Q6A和M7]无法完全适用于寡核苷酸药物。但近几年各国监管机构发布的寡核苷酸药物质量控制的相关指南可供参考。

2.1 中国

目前，我国寡核苷酸药物质量控制指导原则方面亟待发展和完善，但部分内容如残留溶剂等可参考《中华人民共和国药典》（2020年版）。

2.2 美国

美国食品药品监督管理局（FDA）于2021年发布了针对ASO的化学、工艺和质控的指南，列出了针对目前寡核苷酸药物鉴别、检查等方面的建议，为寡核苷酸药物的质量标准制定起到了一定参考作用，如对于寡核苷酸药物的鉴别，FDA的指南中建议选择2种或2种以上方法进行鉴别，为多款新药质量标准的制修订起到了指导作用。

2.3 日本

日本药品与医疗器械管理局（PMDA）在2018年发布了寡核苷酸疗法质量保证和评价考虑要点，该文件中涵盖了寡核苷酸杂质控制的相应内容，但由于该要点发布时间较早，当时全球对于寡核苷酸药物仍不够了解，所以提出的部分内容和建议并不详细。

2.4 欧洲

欧洲制药业成立的寡核苷酸联盟（EPOC）从2020年开始发布一系列针对这类药品的白皮书，涉及鉴别、有关物质、工艺过程控制和稳定性研究等药学研究策略，成为国内外已上市寡核苷酸药物研发中重要的参考性文件之一。2024年7月，欧洲药品管理局（EMA）发布了寡核苷酸药物开发和生产指南，其内容涵盖了寡核苷酸药物的制造过程、表征、规格和分析控制的各个方面，是目前最为详尽的描述寡核苷酸药物质量控制策略的权威指南之一，其中提出了寡核苷酸手性异构体、二级结构（包括Aptamer的三级结构）、热力学转变等鉴别的新要求。

即便如此，寡核苷酸药物作为近年来逐渐发展起来的创新化药品类，质控难度较大，方法开发困难，且目前全球各国药品监管机构在质量控制方法开发与标准化方面均缺乏相关的指导原则可供参考，这一问题也为这类创新药品类质量控制的标准化带来了极大挑战。

 

3寡核苷酸药物的化学修饰与递送系统

与其他药物相比，寡核苷酸具有药效持久，特异性强等优势。但寡核苷酸药物在提高自身稳定性和有效递送到靶标部位等方面仍然存在一系列亟待解决的问题。目前，解决这些问题的策略主要有对寡核苷酸进行化学修饰或通过递送系统以达到靶向递送。

寡核苷酸进行化学修饰主要包括对磷酸骨架、核糖或脱氧核糖以及碱基修饰（图2）。其中，用硫原子取代磷酸二酯（PO）骨架中的非桥接氧原子形成硫代磷酸酯（PS）的方法比较常用，可以提高寡核苷酸对核酶的稳定性，但当PO骨架中的非桥接氧原子被硫取代时，非手性PO键转化为手性PS中心，将会产生2n个非对映异构体，其中n为PS修饰的数量。有试验发现，寡核苷酸药物的药效一定程度上与非对映异构体的组成有关，开发寡核苷酸药物的非对映异构体组成分析方法具有重要意义。

在寡核苷酸的递送系统方面，已上市和在研的药品主要有载体递送和生物偶联递送两种策略。载体递送材料主要有脂质体、聚合物和外泌体等。其中，LNP是应用广泛，具有载药量高的优势，但其存在有毒物质蓄积等方面的问题。目前，应用最广的生物偶联递送策略是将寡核苷酸与GalNAc连接，但GalNAc策略只能靶向肝脏，难以用于非肝脏靶点疾病治疗。除此以外，研究较广的生物偶联配体还有细胞穿膜肽，有希望用于治疗中枢神经系统疾病的药物的递送。

复杂的修饰基团与递送系统，使得本就结构复杂的寡核苷酸药物的质控难度进一步提升。近年来，随着二维液相色谱法（2D-LC）、LC-MS等一系列创新技术成功应用，寡核苷酸药物的质控水平也在不断提升。

 

4寡核苷酸药物有关物质分析

有关物质分析是寡核苷酸药物的质控难点。EPOC的白皮书和EMA发布的寡核苷酸药物开发和生产指南中，将寡核苷酸的产品相关杂质分为4类。I类杂质为与寡核苷酸主成分结构和序列相同的主要代谢物杂质，如缺少3'或5'端一个或多个核苷酸的杂质，或双链寡核苷酸中的单链杂质。II类杂质是指仅含有天然核酸结构元素的杂质，例如硫代磷酸酯寡核苷酸中的磷酸二酯寡核苷酸杂质（PO杂质）。III类杂质指的是母体寡核苷酸的序列变异杂质，如链内缺失或添加核苷酸的n-1、n-2或n+1杂质（而非在3'或5'末端），这类杂质通常与母体寡核苷酸药物难以区分。IV类杂质指含有母体寡核苷酸或天然核酸中不存在的结构元素的杂质，如无碱基杂质和N3-（2-氰乙基）胸腺嘧啶（CNET）杂质，各类杂质的典型杂质结构见表2。

色谱技术被认为是用于寡核苷酸药物质量控制研究最重要的分析手段。在色谱分析中，液相色谱法和毛细管电泳法广泛应用于寡核苷酸药物的质量控制。

4.1 液相色谱法

4.1.1 离子对反相液相色谱法

离子对反相液相色谱法（Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography，IP-RPLC）是分析寡核苷酸和其杂质最常用的液相色谱方法，根据疏水相互作用和静电相互作用将寡核苷酸主成分与其杂质进行分离。在IP-RPLC中，如何选择分析条件使分析物在合理的时间内得到良好的分离依旧是研究者面临的重要挑战。

通过改变离子对试剂和有机溶剂的种类及其在流动相中的比例，可以提高IP-RPLC对寡核苷酸的选择性。目前，六氟异丙醇（HFIP）和三乙胺（TEA）是分离寡核苷酸的首选流动相组成成分。ENMARK等和ZUZANA等对寡核苷酸药物有关物质的分离条件进行了系统性研究，为IP-RPLC方法的开发提供参考。

总体来讲，IP-RPLC适用于分析寡核苷酸药物的大多数杂质，尤其是n-1/n+1杂质，与MS联用被认为是寡核苷酸检测的金标准。但存在PO杂质共流出问题，与MS联用存在一定程度的离子抑制。

4.1.2 离子交换色谱法

离子交换色谱法（Ion exchange chromatography，IEC）在寡核苷酸相关研究中应用广泛，基于电荷差异对分析物进行分离。由于流动相的盐浓度高，在使用MS进行后续测定时，需要进行脱盐处理，操作繁琐。但IEC通常色谱柱压力较低，成本也较低，易于应用在放大纯化寡核苷酸药物中。另外，IEC对PO杂质的分离效果好，常与IP-RPLC结合用于寡核苷酸的纯度分析。

ROUSSIS等使用弱阴离子交换法首次分离出了脱氨基杂质。TOGAWA等研究了siRNA双链及其杂质在IEC中的保留行为。该团队还将IEC应用于硫代siRNA非对映异构体的分离，在单链水平上较好地分离了非对映异构体。

4.1.3 亲水相互作用色谱法

亲水相互作用色谱法（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）是一种不需添加离子对试剂分析极性分子的色谱技术，化合物按极性增加的顺序被洗脱。GILAR等研究发现，HILIC对不同类型的n-1杂质和PO杂质的分离选择性与IP-RPLC不同，有望与其他色谱法相结合用于寡核苷酸药物质量控制。由于流动相中挥发性有机溶剂的含量较高，相对于反相色谱，HILIC与MS耦合的兼容性较好，但与IP RPLC相比，与MS联用的灵敏度低。另外，HILIC还可以作为一种脱盐方法。

4.1.4 二维液相色谱法

寡核苷酸药物有关物质类型多样，与母体结构高度相似，单一的分离模式往往不能够对所有的杂质都实现良好的分离。如通过IEC可以有效地分离长度不同的杂质，但其并不适合分离序列变化不大的杂质。2D-LC为杂质共流出问题提供一种有效的解决方案。VANHINSBERGH等开发了一种多中心切割的2D-LC方法，结合紫外线检测，减少了杂质共流出，提高了对大小和序列相差不大的寡核苷酸杂质的选择性。LI等将2D-LC用于寡核苷酸非对映异构体的研究中。另外，可以将2D作为IEC的脱盐装置，是IEC直接与MS联用的。

色谱分析目前仍然是寡核苷酸药物有关物质分析的重要手段，行业普遍认可的控制策略是将多种色谱分析方法并存于质量标准中，综合评判寡核苷酸药物的产品质量。

4.2 毛细管电泳法

毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）是一种非常有效的寡核苷酸分离技术，根据带负电的寡核苷酸在电场作用下的不同迁移速率来进行分离。与液相色谱法相比，CE可以产生更好的峰形和更高的分辨率，而且不需要使用会抑制MS信号的离子对试剂，另外，由于毛细管的内径较小，在样品体积小的情况下可以获得较高的灵敏度。尽管CE的分离能力较强，并具有多种分离模式可供使用。但CE的重复性和耐用性比液相色谱法低，与MS联用也存在诸多挑战。

4.3 质谱法

MS是表征寡核苷酸及其相关杂质或代谢物的常用工具之一，在药物分析领域占据着重要地位。然而，对于结构性质复杂的寡核苷酸药物及其有关物质，仅使用LC或MS对其进行分析达到的结果是不理想的，往往需要二者的结合。LC-MS在分离选择性和准确度等方面具有优势，已成为寡核苷酸药物质量控制中应用最广泛的检测技术。

GAWLIG等开发了一种液相色谱联用串联质谱（LC-MS/MS）定量寡核苷酸的方法。RENTEL等开发了一种结合紫外（UV）和MS的IP-RPLC方法，可以识别和定量寡核苷酸共洗脱杂质，常用于确定原料药和药品的含量、纯度和杂质。

目前，LC-MS技术已经越来越多应用于寡核苷酸药物质量控制中，其较强分离能力（不仅能够实现色谱分离，还能够依据相对分子量进行分离）使得寡核苷酸药物的精准质量控制成为可能，基于LC-MS技术将是未来寡核苷酸这类创新化学药品有关物质分析与含量测定的重要方向。

 

5寡核苷酸药物的鉴别

在寡核苷酸的鉴别方面，由于这类药物主成分与有关物质之间难以实现有效分离，无法采用色谱保留时间（像其他小分子药物）比对的方式准确鉴别。并且由于其结构单元的高度相似性，采用红外、UV等光谱技术也无法实现特异性鉴定该类产品目标。除此之外，寡核苷酸药物的高级结构可能会影响药物的安全性与有效性，因此，针对性地鉴别其高级结构也是保障产品质量的重要环节。EMA的寡核苷酸药物指导原则中介绍了寡核苷酸的表征技术，并明确提出寡核苷酸结构表征应重点提供二级结构等关键信息。

5.1 熔融温度（熔化温度）法

寡核苷酸的熔融温度（Melting Temperature，Tm）是指50%寡核苷酸双链解离的温度，是反映寡核苷酸双链稳定性的一个指标。其与寡核苷酸的碱基组成、序列长度有关，随着温度的变化，寡核苷酸双链解离，UV吸光度发生改变，因此，可以利用这种性质对寡核苷酸进行序列匹配性鉴别。

5.2 圆二色谱法

寡核苷酸的序列、化学修饰会影响其二级结构，从而影响其安全性与有效性，因此，可以从CD光谱中判断出寡核苷酸药物的二级结构信息，确保其质量与安全。

5.3 核磁共振技术

核磁共振技术（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）可以用于确定寡核苷酸的二级结构，包括碱基对的数量。核磁共振结构指纹识别方法最近被引入到寡核苷酸药物终产品药学研究中，未来有望应用于寡核苷酸药物结构的深度解析与质控中。

5.4 高分辨质谱测序技术

高分辨质谱（HRMS）是快速、准确解析寡核苷酸结构的理想工具，能够直接、全面表征寡核苷酸序列化学修饰。HRMS通过检测寡核苷酸完整分子或化学诱导裂解或者酶促裂解后得到碎裂片段的质荷比来推断序列。

随着结构表征手段的不断丰富，尤其是对于寡核苷酸药物关键质量属性认知的不断深入，必将使得建立更为规范的、更加标准化的寡核苷酸药物结构鉴定策略成为可能。

 

6寡核苷酸药物含量测定方法

目前，寡核苷酸药物含量测定的方法UV检测或MS检测。UV是最简单的寡核苷酸定量方法，基于寡核苷酸在260nm处的吸收光谱实现定性和定量分析，但一些杂质如蛋白质和有机物质，在该波长处也会有吸收，使结果的准确性较差。

MS是寡核苷酸含量分析中十分具有前景的分析工具。由于其能够通过相对分子量的差异分离出不同杂质与主成分，近年来，逐渐成为寡核苷酸药物含量测定的主要手段之一。如RENTEL等开发的IP-RPLC-UV-MS方法，对35种不同的ASO原料药和产物进行了验证。该方法具有良好的重现性、准确性与耐用性。另外，采用内标MS进行含量测定，只需几分钟就可实现基于MS的定量，能够显著提高了检测效率。

 

7讨论与展望

化学合成技术和药物递送策略的进步促进了寡核苷酸药物产业的快速发展。但寡核苷酸药物结构复杂，鉴定表征难度较大，且有关物质与寡核苷酸药物结构高度相似，增加了有关物质分析的难度。此外，这类药物的含量测定普遍采用MS技术，但目前寡核苷酸药物MS定量的标准化方法缺失，使得这类产品的准确定量难度较大。为了实现更为精准的控制寡核苷酸药物的质量，确保该类创新药产品的安全有效，仍然需要在以下几个方面开展更为深入的研究。

7.1 更为精准的有关物质分析方法

寡核苷酸药物杂质组成复杂，尤其是PS键导致的非对映异构体含量较多，且难以有效分离，使得这类产品的安全性、有效性受到了严重影响。基于LC-MS开展针对寡核苷酸药物杂质的精准分析，未来极有可能成为寡核苷酸药物产品质控方法研究的重要方向。

7.2 更为精准的特定杂质质控限度

寡核苷酸药物作为基因治疗类药物，ASO和siRNA均为通过碱基互补配对原则发挥生物学作用，其杂质尤其是碱基序列缺失杂质同样存在碱基错配的风险，可能产生脱靶毒性。因此，建议充分评估不同寡核苷酸药物杂质的风险，制定更为合理的质控限度。

7.3 更为全面的鉴别方法

寡核苷酸药物的主成分与杂质之间分离难，使得其很难通过保留时间比对产品实现充分鉴别，因此需要借助MS、热分析技术等，对产品的结构进行全面的评判。近年来，寡核苷酸药物的高级结构越来越被关注，因此，未来用于表征药物高级结构的CD、三维NMR等技术也越来越多的用于寡核苷酸这类创新药的质量控制中。

7.4 更为精准的含量测定方法研究

目前寡核苷酸药物质量标准的含量测定方法已经越来越多采用MS进行测定，但受限于MS重现性的问题，结果重现和转移仍较为困难，因此，亟需开发更具通用性的基于MS的含量测定方法以及准确性验证方法，确保寡核苷酸药物含量的准确控制。

总的来讲，寡核苷酸药物发展前景广阔，但仍有很多方面值得深入研究。随着技术的进步以及研究的深入，亟需开展药物分析、药物毒理学、基因组学、蛋白组学等学科与技术的交叉研究，推动寡核苷酸药物质量与安全的不断提升，让这类创新产品更好地服务于人类生命健康。

 

来源：Internet

关键词： 寡核苷酸 药物 质控关键技术