常常听到萌新师妹抱怨，细胞冻存得好好的，后面想用时怎么就用不了呢？

 

实际上，细胞冻存的重要性不亚于细胞培养。小析姐在此对细胞冻存的原理及方法步骤进行梳理，希望能够帮助到为细胞冻存实验「头秃」的科研人。

 

一、细胞冻存的原理

 

传统的细胞冻存（甘油/二甲基亚砜作为保护剂）实验讲求的要点是：慢冻速溶。

 

细胞冻存时向培养基中加入的甘油或二甲基亚砜（DMSO），这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

 

当细胞生长至对数中晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻，后转移至液氮环境中长期保存。

 

二、细胞冻存的步骤

 

1.  预先配制冻存液：按正常培养基：DMSO =9:1比列配制冻存液；

 

2.  取对数生长期细胞，用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来，离心转速为1000 rpm，离心时间为5 min；

 

3.  去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量提前配制好的细胞冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/mL～1×107/mL；

 

4.  将细胞分装入冻存管中，每管体积约为1～1.5 ml；

 

5.  在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间、细胞代数及操作者的名字，以便于后续溯源信息；

 

6.  提前往冻存盒中加入异丙醇（在负八十冰箱中能以1℃/min的速度下降），随后放入-80℃的低温冰箱即可，建议冻存时间为12小时以上。冻存完成的细胞一般能够在-80℃冰箱中保存半年至一年，长期保存要转移至液氮中，商用冻存液可以直接将冻存管放置于-80℃冰箱中。

 

缠有封口膜的冻存管，从液氮拿出来时场景，是这样的 

 

缠有封口膜的冻存管，细胞复苏时场景，又是这样的

 

 

细胞冻存时，冻存管管口到底要不要缠封口膜？

 

1、细胞冻存管管口不缠封口膜的原因：

 

a、封口膜在负80 冰箱长时间冻存会变性松开或断裂，尤其在液氮罐内长期保存更容易变性、脱落，污染液氮。

 

b、细胞复苏时，松动或脱落的封口膜会影响实验操作。脱落到水浴锅内，增加污染（塑料垃圾污染和微生物污染）概率。

 

c、实验室剪裁封口膜时，就没有准备适合冻存管口宽度的封口，拿啥缠呢。

 

d、省钱省时间。十年来，冻存了2万多管细胞。要是每管都贴封口膜，剪裁后的封口膜连接在一起，是否可以绕地球走1/10000圈呢。

 

e、缠上风封口膜，冻存盒相邻的冻存管会很挤，很难放入冻存盒。

 

2、多年实验实践和经验表明：不贴封口膜，冻存液不会溢出来（密封性），也不会增加污染概率，更不会影响冻存管的安全性。

 

所以，我们实验室冻存细胞时，冻存管口不缠封口膜。

 

3、细胞冻存时，将冻存管放入程序降温盒前，轻轻拧紧一下管盖。避免冻存后管盖缝隙微小收缩，入液氮后，液氮进入冻存管内。可降低细胞复苏时，胀气后出现爆的概率。

 

来源：Internet

关键词： 细胞冻存管 封口膜