氨基酸是生命活动的必需物质，20种基因编码氨基酸组成了蛋白质骨架，在代谢过程中发挥着重要的作用。除甘氨酸外其他氨基酸均有手性中心，分别含L构型和D构型两种对映异构体。

 

生理环境是手性的，因此不同构型的氨基酸的生物活性差异很大。L-构型氨基酸可以通过聚合反应形成生命系统中的多肽和蛋白质。在生命系统中也发现某些D-氨基酸以游离氨基酸形式存在或组成多肽、蛋白质的一部分。有文献报道[1]，某些D-氨基酸是哺乳动物和人体中重要的信号分子。如D-丝氨酸在中枢神经系统中发挥重要作用[2]，D-门冬氨酸则在内分泌系统和神经内分泌系统中发挥作用[3]。

 

在过去20年里有大量关于氨基酸手性拆分的方法。分析方法基于高效液相色谱法、毛细管电泳、酶和免疫化学生物传感器等。最常用的方法是高效液相色谱法，一般采用柱前或柱后衍生法提高方法灵敏度。

 

间接法是基于手性衍生试剂与氨基酸反应形成非对映体，利用非手性固定相对生成的非对映异构体分离；而直接法则基于在手性固定相上分离对映异构体氨基酸。为了有效分离氨基酸对映异构体，研究者采取上述两种方法，并选择丝氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸作为研究对象，分别对7-氯-4-硝基苯（NBD-Cl）和2，4-二硝基-5-氟苯基-L-丙氨酸（FDAA）两种衍生方法进行了比较。

 

（1）NBD-Cl柱前衍生：200μl 样品溶液，加200μl硼酸盐缓冲(100mmol/L，pH8.5)，加200μl NBD-Cl（4mmol/L）混合，混合物涡旋，避光，60℃水浴加热1小时，在氮气流保护混合物置50℃下蒸发，蒸发后残渣溶于1ml流动相。空白溶液用水代替样品溶液，其他处理方法与样品溶液保持一致。

 

色谱条件：手性色谱柱：Sumichiral OA-2500S(250mm*4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流速：0.5ml/min；流动相：甲醇-乙腈（1:1），含柠檬酸5mmol/L；检测波长:470nm；进样体积；20μl。

 

（2）FDAA柱前衍生：200μl 样品溶液，加40μl碳酸氢钠溶液（1mol/L），加200μl 1%的FDAA溶液混合，混合物涡旋，避光，40℃水浴加热1小时。冷却后加20μl盐酸溶液（2mol/L）。混合物11873×g离心5分钟后进液相分析。

 

色谱条件：非手性色谱柱：Kromasil C18(150mm*4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；流动相：乙腈-0.2%乙酸（35:65，V/V）；检测波长：340nm；进样体积；20μl。

 

衍生化过程和流动相的组成可能会影响灵敏度和分离度。两种衍生方法的手性拆分结果如表1所示，从氨基酸的检出限和定量限看，NBD-Cl衍生方法均低于FDAA衍生方法。但对映体经两种方法衍生后，分离度无明显差异。

 

表1 两种衍生方法的氨基酸对映体手性拆分结果

研究者以消旋丝氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸作为模型分析物，以NBD-Cl作为衍生试剂，对NBD-Cl的浓度、pH以及衍生反应的温度和时间进行了优化，优化结果如图1 所示。

 

图1 衍生反应条件的影响

（A：衍生试剂的浓度  B：衍生试剂的pH  C：反应温度  D：反应时间）

 

由图1A可知，1mmol/L的氨基酸与4-5mmol/L的NBD-Cl衍生，可以得到最高产率。衍生反应需要在碱性条件下发生，图1B比较7.5、8.0、8.5、9.0的硼酸盐缓冲液可知，碱性越强，产率越高，但随着pH的急剧增加，尤其是当pH超过8.5时，副产物的生成增加。研究者还优化了衍生化反应的温度和衍生化时间，图1C和1D可知，反应温度越高，反应时间越长，产率越高。当温度高于60℃或反应时间超过60分钟，反应产率增加的速率变慢。

 

研究者还对色谱条件进行了优化。分离NBD-氨基酸衍生物时，发现当乙腈比例增加到50%（乙腈：甲醇，V/V）时，有利于氨基酸对映异构体的分离。当流动相中添加一定量的酸时，有助于氨基酸对映异构体的分离，且柠檬酸比甲酸、乙酸、氢氟酸效果更好。

 

专属性实验对11种衍生化D、L氨基酸对映体(图2 A-K左边)和空白样品(色谱图中未显示)的色谱图进行比较，发现空白样品不干扰氨基酸对映异构体的分离。进样单一构型的氨基酸衍生物，可知NBD -(D)氨基酸对映体先出峰，NBD-(L)氨基酸对映体出峰在后。

图2  11对氨基酸对映体分离的典型色谱图

（左：含0.5%D-氨基酸的L-氨基酸溶液；右：L-氨基酸实际样品）

（A-K分别为丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸）

 

线性、检出限、定量限结果如表2所示，D-氨基酸浓度范围0.40-3.20μg/ml，均溶于浓度为80.00μg/ml的L-氨基酸溶液中。结果所有待测氨基酸线性曲线，相关系数r＞0.9975，定量限均高于0.40μg/ml。

 

表2  11种D-氨基酸的线性、检出限、定量限结果

 

重复性、中间精密度、回收率结果如表3所示，重复性和中间精密度RSD均低于10%，方法精密度良好。含0.5%的D-氨基酸样品溶液衍生后，分别于0、2、4、8、12小时进样检测，RSD均小于2.4%，方法稳定性良好。样品检测结果显示不含D-氨基酸杂质，回收率实验分别添加含量为0.5%、1.0%、2.0%的D-氨基酸杂质进行验证，结果RSD均小于3%，方法准确性良好。

 

表3 11种D-氨基酸的精密度、重复性、回收率结果

 

综上所述，作者开发了一种检测一系列L-氨基酸对映异构体纯度的高效液相色谱法。方法以NBD-Cl柱前衍生氨基酸以提高检测灵敏度，衍生后的氨基酸对映异构体通过手性柱分离，流动相含0.1%柠檬酸的甲醇-乙腈（1:1）溶液，流速：0.5ml/min。检测波长：470nm。11对氨基酸异构体均可分离。在L-氨基酸大量过量的前提下，仍可对微量的D-氨基酸（0.5%）异构体进行定量。该方法经过专属性、精密度、线性、定量限、检出限、准确度验证，并成功应用于大量样本的检测。

 

参考文献

 

[1]Friedman, M. (2010). Origin, microbiology, nutrition and pharmacology of D-amino acids. Chemistry & Biodiversity, 7, 1491–1530.

 

[2]Fuchs, S. A., Dorland, L., de Sain-van der Velden, M. G., Hendriks, M., Klomp, L. W.,Berger, R., et al. (2006). D-serine in the developing human central nervous system. Annals of Neurology, 60, 476–480.

 

[3]Yamamoto, A., Tanaka, H., Ishida, T., & Horiike, K. (2010). D-aspartate oxidase localisation in pituitary and pineal glands of the female pig. Journal of Neuroendocrinology, 22, 1165–1172.

 

 

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关键词： 氨基酸