色谱柱及其固定相的发展是色谱分析技术中的重要组成部分，其发展历程体现了科学技术的不断进步和创新。今天来跟大家聊聊对色谱柱及其固定展以及工作中色谱柱选择。

 

1、液相色谱柱的发展

 

1、早期发展

 

      液相色谱柱最初多采用碳酸钙、硅胶、氧化铝等填充的玻璃柱管，流动相通过重力作用向下迁移，组分的检测则依靠肉眼观察或吸附剂从柱管中取出后的进一步分析。这一阶段的液相色谱柱效和分离能力相对较低。

 

     六十年代至七十年代：六十年代，随着气相色谱知识的积累，气相色谱中的系统理论与实践经验被应用于液相色谱研究，细粒度高效填充色谱柱的研制成功大大提高了液相色谱的分离能力。

 

      七十年代，高压泵的应用替代了重力作用，使得流动相能够更高效地通过色谱柱，进一步提高了柱效率和分析速度。同时，适合分离生物大分子的填料成为研究热点，推动了液相色谱柱在生物化学领域的应用。

 

      八十年代至今：八十年代以后，液相色谱柱的制造技术不断改进，填料粒径不断降低，更高的柱效得以实现。同时，色谱柱的材质、形状等也经历了多次革新，如球形颗粒的广泛应用提高了分离效率。

 

      九十年代以来，超高压力液相色谱（UPLC）的出现极大提高了分离效率，使得液相色谱可以应用于更加广泛的领域。此外，非线性色谱、工业色谱技术等也获得了长足的发展，推动了液相色谱柱技术的多元化应用。

 

2、亚2μm颗粒

 

      1956年，Van Deemter 就给出了使用非常小的颗粒进行快速、高效分离的预测在过去几年中，典型填料的粒径不断减小，21世纪初的研究主要集中在亚2pm的硅胶颗粒上。正如预测的那样，这些粒子 (例如，1.7pm)可以产生卓越的性能 (约280000块塔板/m或约4pm/块塔板)。然而，填充亚2pm粒子的色谱柱会产生高的背压，通常采用填充内径为2.1mm的色谱柱的方式，通过黏性发热减小效率损失。

 

     对高压力和低分散(减少附加柱的谱带展宽)系统的要求导致了现代UHPLC系统的特点。进一步降低粒径至小于1.5μm可能会产生更高的速度和性能。然而，它也必须伴随着系统压力的大幅增加和毛细管色谱柱内径的减小。核壳结构颗粒Kirkland熔融的核或者核壳粒子可以减小质量转移过程中的阻力。近年来研发的第一个核壳粒子具有如下特点：2.7μm表面多孔硅材料，无孔的核心 (1.7μm)和多孔的壳层(厚0.5μm)。这些亚3μm的颗粒与亚2pm的完全多孔材料相比似乎具有相似的效率，但是可以产生更低的压降。这种特殊的性能可能是由于壳体较短的扩散路径，或者比较狭窄的填料分布。

 

     由于快速分离和在生物分子方面的应用，核壳色谱柱迅速获得广泛的接受。越来越多的制造商可以提供各种键合相和不同尺寸的粒子(1.3μm，1.7μm, 2.6μm，1.3μm和5μm。因此，与多孔微细颗粒的色谱柱相比，这些色谱柱在所有应用中具有很强的竞争力。杂化将有机基团引入到无机硅基体中形成杂交颗粒的理念在20世纪70 年代首次由Un-ger提出，然而第一根具有甲基基团的商业化的色谱柱在1999年才正式推出。与传统pH范围为2~8的具有常规单功能键合的硅颗粒相比，这些混合物中的键合相被证明具有很好的pH稳定性(pH范围为1-12)和较低的亲硅基活性。2005 年，引入第二代桥联乙烯杂化(BEH)，在高 pH值流动相以及UHPLC的应用上获得了极好的反响。

 

     硅胶基质键合相由于批次之间重现性较好，仍是应用领域主要的产品。但是，新的键合化学反应使困难的分离(如极性嵌入式、苯基、己基苯基、氰基、戊烷氟苯基键合)的pH值稳定范围更宽(多官能的硅烷化学键或异丙基保护的硅烷)，选择性增强。最近的一个创新方法称为表面带电杂化(CSH) 技术，该项技术于2010年引入，由于在酸性、低离子强度流动相 (如0.1%甲酸)条件下，对高碱性分析物的峰形的改善，该项技术立即在药物分析领域获得了很好的接受度。亲水作用色谱(HILIC)在反相 HPLC条件下，若流动相中有机物含量比较低，就会导致相坍塌现象(键合相脱水)，许多强极性化合物就无法获得足够的保留时间或者会存在问题。

 

     20世纪90年代由Alpert首次开发了 HILIC模式，使用亲水固定相(硅、二醇、氰基、氨基两性离子等)，以水和乙睛作为流动相，在极性药物分析、辅助药物代谢、氨基酸、多脑、神经递质、低聚糖、碳水化合物、核昔酸或核昔方面的分析中越来越受欢迎。HILIC的实际保留机制可以认为是分析物分子“分区”到附着在亲水结合基团的水层。与RPLC相比，HILIC其他突出的优势包括“正交”选择性(样品制备兼容两种模式)，对质谱具有更高的电喷雾离子化灵敏度 (515倍)，较低的操作压力。

 

2、固定相的发展

 

类型与选择：固定相的选择对样品的分离起着重要作用。不同类型的色谱采用的固定相也不同，如正相色谱采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相），反相色谱则用非极性固定相（如C18、C8），离子交换色谱中的固定相则是各种离子交换剂等。

 

发展历程：早期使用的固定相粒径较大，分离效率有限。随着技术的进步，研究人员不断尝试使用微粒固定相以提高柱效，如科克兰等制备成功的薄壳型固定相就实现了高速传质。七十年代后，全多孔球形硅胶等新型固定相的出现进一步提高了柱效和稳定性。同时，键合固定相的发展使得色谱柱能够多次使用而不失活。九十年代以来，随着对分离选择性的要求不断提高，人们开始尝试改变流动相的组成以提高选择性。此外，新型高分子材料作为固定相的研究也取得了显著进展，为色谱固定相的发展提供了新的方向。

 

当前趋势：目前，HPLC固定相基质中硅胶的应用约占75%，聚合物约占20%。同时，随着对复杂样品分离需求的增加，研究人员正在不断探索新型固定相材料以提高分离效率和选择性。值得注意的是，整体柱（Monolithic Column）作为一种新型色谱柱技术近年来受到了广泛关注。整体柱具有制备简单、传质阻力小、耐压能力强等优点，在复杂样品分析中具有广阔的应用前景。

 

3、液相色谱柱选择的简单思路

 

1、确定分离目的确定你的应用是否要求高分离度、短分析时间、高灵敏度、长柱寿命，低的实验成本等。

 

2、评估分析物的化学性质评估分析物的化学性质。诸如化学结构、溶解性、稳定性等。

 

3、选择合适的色谱柱了解色谱填料的物理和化学性质。

 

4、液相色谱柱选择的条件

 

1、填料基质

 

（1）硅胶基质：纯度高本钱低，强度大，化学修饰轻易，但pH值范围有限。大多硅胶基质填料在pH 2-8之间稳定，但经过特殊修饰的硅胶键合相可以稳定在pH 1.5-10。

 

（2）聚合物基质：应用pH值范围宽，温度稳定(高温可以达到80℃以上)，机械强度小。

 

2、颗粒外形

 

     大多现代HPLC填料都是球形颗粒，但有时是不规则的颗粒。球形颗粒提供较低的柱压、较高的柱效和稳定性以及较长的柱寿命在使用高粘度的活动相时;不规则颗粒有较大比表面积和相对低廉的价格。

 

3、颗粒粒径

 

     粒径越小柱效越高、分离度越高，但同时会导致较高柱压降。选择1.5-3μm的填料以解决一些复杂样品，UPLC可以使用1.5μm的填料，另外10μm或更大粒径的填料用作半制备或制备柱。

 

4、含碳量

 

     含碳量指的是硅胶表面键合相的比例，与比表面积和键合覆盖度等有关。高含碳量进步柱容量、分辨率及分析时间，用于要求高分离度的复杂样品；低含碳量分析时间短、展现不同的选择性，用于快速分析简单样品及需要高含水活动相条件的样品。一般C18的含碳量在7-19%不等。

 

5、孔径和比表面积

 

     HPLC吸附介质是多孔的颗粒，尽大多数的反应表面于孔内。因此，分子必须进进孔内才能被吸附和分离。孔径和比表面积是相辅相成的两个概念。孔径小比表面积大，反之亦然。比表面积大，增加样品与键合相之间的反应，增加保存,上样量和复杂成分的分离度;比表面积小，平衡时间快，适合梯度分析。

 

6、孔容和机械强度

 

     孔容，又称“孔体积”。指单位颗粒的空隙体积大小。它能很好的反应填料的机械强度。孔体积大的填料相对孔体积小的填料机械强度要略弱。孔体积为1.5mL/g或更小的填料大多用于HPLC分离，而孔体积大于1.5mL/g的填料使用于尺寸排阻色谱和低压色谱。

 

7、封端

      封端能够降低极性碱性化合物由于与裸露的硅醇基相互作用而产生的拖尾峰。不封端键合相相对封端键合相会产生不同的选择性，尤其是极性样品。

 

 

来源：分析与GMP

关键词： 色谱柱