一、实验原理

 

鬼笔环肽是从毒蕈中提取的双环七肽，对肌动蛋白具有高度特异性和亲和力，能紧密且稳定地与纤维状肌动蛋白（F-actin）结合，防止其解聚。在实验中，先将细胞固定以维持形态，再用适当试剂进行通透处理，使鬼笔环肽得以进入细胞内与F-actin特异性结合。同时，鬼笔环肽可与荧光染料如FITC、TRITC等进行标记。

 

 

 

当用标记后的鬼笔环肽处理细胞后，在荧光显微镜下，结合了荧光染料的鬼笔环肽-F-actin复合物会发出荧光，从而清晰地显示细胞内肌动蛋白微丝的分布与形态，便于对细胞骨架进行观察和研究。

 

二、实验步骤

 

1）PBS清洗细胞：细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度；用PBS洗两遍。

 

2）固定细胞：用4%甲醛作固定剂，室温下让细胞与之接触10-20min，甲醛渗透进细胞，交联蛋白、核酸，维持细胞形态，之后用PBS洗涤细胞。

 

3）细胞透化：固定后，用0.5%TritonX-100作透化剂，室温静置约5min，它可削弱细胞膜屏障，助鬼笔环肽入细胞，之后用PBS洗涤细胞。

 

3）鬼笔环肽染色：向细胞加荧光标记鬼笔环肽溶液，室温孵育20-30min，使其与F-actin精准、特异性结合，利于观察细胞骨架。

 

4）洗涤与封片：染色后，用PBS缓冲液多次冲洗细胞，去除多余鬼笔环肽；再用含DAPI的抗淬灭封片剂封片，防止荧光淬灭，便于显微镜观测。

 

三、注意事项

 

1）鬼笔环肽对pH值敏感，如果pH值升高，鬼笔环肽中关键的硫醚桥键会被裂解，丧失与肌动蛋白的结合力，影响后续实验。

 

2）不能使用含甲醇或丙酮的固定剂，甲醇、丙酮会严重破坏肌动蛋白结构，使其化学键断裂、多肽链变形，丧失正常功能。

 

3）不能将鬼笔环肽直接应用于活细胞的染色，因为它无法穿越细胞膜。

 

4）悬浮细胞因其游离特性，给染色流程增添了难度。但可借助多聚-D-赖氨酸对微孔板、盖玻片预先进行修饰处理，利用其带有的正电荷与悬浮细胞表面负电荷间的相互作用，促使悬浮细胞顺利附着。细胞贴壁完成后，即可套用现行的贴壁细胞染色方案，精准、高效地达成染色目的。

 

例：如图为人骨髓间充质干细胞细胞（hBMSCs）骨架检测。免疫荧光图像显示了不同PLGA/Mg-GA-MOF支架上hBMSC的形态。人BMSC细胞核用DAPI（蓝色）染色，细胞骨架用FITC（红色）染色。

 

 

来源：实验老司机

关键词： 鬼笔环肽细胞骨架染色