前言

 

细胞库检定和病毒清除验证由于涉及到病毒检项，企业一般会选择第三方服务商来处理。但是由于中国和欧美在这个项目上的法规不同，导致需要同时考虑海外市场的企业要花额外的精力去设计一个满足双报需求的方案。2020年1月21日，国家药品监督管理局（简称：NMPA）发布“国家药监局关于适用《Q2（R1）：分析方法论证：正文和方法学》等11个国际人用药品注册技术协调会指导原则的公告（2020年第7号）”。公告明确：本公告发布之日起6个月后（即：2020年7月10日）开始的药学研究（以试验记录时间点为准），适用ICH指导原则, 其中包含了ICH Q5A (R1)和Q5B。这表明了国内法规和欧美法规有趋同的趋势，也对双报项目病毒安全性的管理产生了影响。此外2020年新版药典即将发布，在此，也根据征求意见稿的情况加以讨论。

 

简介

 

使用细胞（人源或动物源）生产的生物技术产品的一个共同特点是存在病毒污染的危险性，这种病毒污染在临床上可产生严重的后果。病毒污染可来自细胞系(细胞基质)本身，也可来自生产过程中偶然带入的外源病毒。病毒安全性始终是产品质量研究的一项重要环节，一般通过细胞库检定、原辅料测试以及纯化工艺的病毒清除验证来保证工艺过程中的生物安全性。但是，由于国内外申报所依据的法规不同，具体要求也会有所差异。

 

其中，ICH Q5A（R1）：《来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价》是关于国外生物技术产品申报材料病毒安全性评价的主要参照法规。另外，对于FDA申报，美国药典、Pointsto Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products forHuman Use、Pointsto Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals以及9 CFR等也是需要参照的法规；同样，对于EMA来说，需要参照欧洲药典、Guidelineon Virus Safety Evaluation of Biotechnological IMP等一系列相关法规。而中国国内申报主要依据《中国药典》第三部（2015版）“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”和《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》。这种评价依据差异情况使得中外双报的项目需要充分考虑中国和海外申报区域法规的不同，而不能简单地将一套数据应用在另一个地方。

 

本文将从（1）对细胞系和其他原材料进行选择和测试，确保其不含可能对人有感染和/或致病作用的病毒。（2）对生产工艺中清除病毒的能力进行评估。等两个方面，对中外申报材料中病毒安全性评价的差异和趋势进行论述。

 

细胞系和其他原材料的病毒检测

在生产生物制品时，需要建立多级细胞库，包括原始细胞库（PCB），主细胞库（MCB），工作细胞库（WCB）以及生产终末细胞库（EOPC）等。不同的细胞库所具有的功能不同，ICH以及各国的法规对其病毒检定的要求也是不同的。

 

（1）其中ICHQ5A(R1)规定不同级别细胞进行的病毒测试方法（表一）：

	MCB	WCB	代次限制细胞a
逆转录病毒和其他内源病毒的测试
感染性试验	+	-	+
电镜	+b	-	+d
逆转录酶	+c	-	+c
其他特异病毒试验	如适用d	-	如适用d
非内源性或外源病毒测试
体外测定	+	-e	+
体内测定	+	-e	+
抗体产生检测	+f	-	-
其他特异病毒检测	+g	-	-

 

a 达到限传代次的细胞:在体外达到传代限度的生产细胞

 

b 也可测定其他因子。

 

c 若逆转录病毒感染试验为阳性，则无须作。

 

d 指适用于已受此因子感染的细胞系。

 

e 第一个WCB时，此测试应在该WCB产生的达到体外限传代次细胞上进行；以后的WCB，可直接在WCB上进行单项体外和体内测试，或在达到体外限传代次的细胞上测试。

 

f 例如MAP、RAP、HAP--通常适用于啮齿细胞系。

 

g 例如，适用于人、非人灵长目或其他细胞的测试方法。

 

（2）中国药典第三部（2015版）（表二）：

检测项目		MCB	WCB	EOPC①
内、外源病毒污染检查	细胞形态观察及血吸附试验	+	+	+
	体外不同细胞接种培养法	+	+	+
	动物和鸡胚体内接种法	+	-	+
	逆转录病毒检査	+	-	+
	种属特异性病毒检查	（+）	-	（+）
	牛源性病毒检查	（+）	（+）	（+）
	猪源性病毒检查	（+）	（+）	（+）
	其他特定病毒检查	（+）	（+）	（+）

 

注：①表示生产终末细胞，是指在或超过生产末期时收获的细胞，尽可能取按生产规模制备的生产末期细胞。“+ ”为必检项目，“-”为非强制检定项目。（+）表示需要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检定项目。

 

由以上可知，对于各级细胞库，我们应该全面的梳理细胞的特性、培养历史以及操作过程，然后对病毒安全性做出合理的评估和检测。根据ICH Q5A的要求，应对MCB进行内源性和非内源性病毒污染的检测；如果不检测MCB，也可以使用WCB全面检测进行替代。另外，还要求对达到体外细胞传代限次细胞进行病毒检测。根据中国药典第三部（2015版）MCB需要进行全面的检测，并且要求对EOPC进行检定，而ICH法规规定在申报IND之前对EOPC检定没有要求。如果要进行中外双申报，建议依据中国法规进行EOPC的检定，并且对EOPC进行与MCB检定要求一致的检定。

 

如果在细胞系构建、细胞建库过程或者生产过程中使用了动物源成分，则需要开展有针对性的病毒检测，如牛源性病毒和猪源性病毒检测。对于牛源性病毒（牛血清等）来说，美国要求参照9CFR，涉及的病毒检测包括BVDV,BAV5, BPV, BTV, BRSV, REO3, RV, IBR, PI3等病毒，而中国药典要求检测的病毒为BPI3, PI3, BAV-3, BPV, BVDV, REO3, RV等病毒。同样，对于猪源性病毒（胰蛋白酶等），美国要求参照9CFR，需检病毒为PPV,TGEV, PAV, REO3, HEV, BVDV, PI3, RV等病毒，而中国药典没有具体规定，需要根据具体情况来进行评估和检测。

 

另外，ICH规定：对于啮齿类动物细胞系中的物种特异性病毒的检测，可将被测试样品接种到无病毒的动物中去，经一段特定时间后测定其血清抗体水平或酶活性。这种试验包括：小鼠抗体产生试验(MAP)、大鼠抗体产生试验(RAP)和仓鼠抗体产生试验(HAP)。而中国药典第三部（2015版）也提及相关的试验，但是没有提及具体检测的病毒。在中国药典（2020版）增加了“鼠源性病毒检查法”，要求检定8中鼠源性病毒，分别为淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、出血热病毒、脱脚病病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、III 型呼肠孤病毒、小鼠腺病毒、小鼠白血病病毒，这也可以作为我们进行抗体产生试验的一个参考。事实上不同的动物对不同的病毒灵敏度及反应性不同，这是为什么法规会推荐多种动物进行抗体实验的原因。

 

ICH Q5A(R1)规定具体参加下表（表三）：

MAP	HAP	RAP
脱脚病病毒[2，3]	淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒[1，3]	汉坦(Hantaan)病毒[1，3]
汉坦病毒[1、3]	小鼠肺炎病毒(PVM)[2、3]	基尔汉姆（Kilham）大鼠病毒(KRV)[2、3]
K病毒[2]	呼肠病毒3型(Reo3)[1、3]	小鼠脑脊髓炎病毒 (泰累尔，GDVⅡ)[2]
乳酸脱氢酶病毒(LDM)[1、3]	仙台(Sendai)病小鼠肺炎病毒[1，3]	小鼠肺炎病毒（PVM）[2，3]
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(ICM)[1，3]	SV5	大鼠冠状病毒(RCV)[2]
小鼠小病毒[2，3]	-	呼肠病毒3型（Reo3）[1，3]
小鼠腺病毒（MAV）[2、3]	-	仙台病毒[1、3]
小鼠巨细胞病毒（MCMV）[2、3]	-	巨唾液腺炎病毒（SDQV）[2]
小鼠脑脊髓炎病毒(泰累尔，GDVⅡ)[2]	-	图兰(Toolm)病毒[2、3]
小鼠肝炎病毒（MHV）[2、3]	-	小鼠小轮状病毒(EDIM)[2、3]
小鼠肺炎病毒(PVM)[2、3]	-	-
多瘤病毒[2]	-	-
呼肠病毒3型	-	-
(Reo3)[1、3]	-	-
仙台病毒[1、3]	-	-
胸腺病毒[2]	-	-

 

注：1、有证据表明能感染人和灵长目动物的病毒；2、无证据表明能感染人的病毒；3、能在体外细胞中进行复制的来源于人或灵长目动物的病毒 

对生产工艺中清除病毒的能力进行评估

（1）未经处理的原液（UPB）病毒检测

 

UPB包括集中回收的一批或多批细胞和培养基，如果存在病毒或病毒样颗粒，其浓度是最为富集的，容易检出。根据 ICH Q5A 的建议，生物制品在进行上市注册申请时，至少应上报 3 批中试生产或规模化生产的未经处理原液的病毒安全性研究资料。《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》要求在申报IND之前就应该进行3批中试生产或规模化生产的未经处理原液的病毒安全性研究。

 

在UPB病毒安全性评价时，一般使用多种细胞系进行体外筛查试验；如适用，可使用聚合酶链式反应(PCR) 或其他适当的方法。另外，ICHQ5A(R1)也要求对UPB需进行电子显微镜检测以检测逆转录病毒的存在。

 

（2）生产工艺病毒去除/灭活的验证与研究

 

在生物制品的生产工艺步骤中要求设计病毒去除/灭活步骤，以对潜在的病毒污染风险进行控制。并且，在开展人体临床试验前，进行初步的验证与研究，说明设置步骤的合理性和有效性。2019年6月27日，国家药典委员会发布了《生物制品病毒安全性控制公示稿》，这个药品标准草案的公示无疑把生物制品的病毒清除/灭活的标准化提上日程。

 

进行国外申报或者中外双报，由于指导原则的不同必然造成国内外申报存在一些差异（表四）。在IND申报时，中外在指示病毒选择、工艺选择以及重复性上差异较大；而在BLA申报时，中国国内在指示病毒选择和工艺选择上会参照国外的指导原则和法规（ICH Q5A等），而重复性上要求三批次。

 

表四：国内外申报病毒清除验证的差异比较

步骤	IND		BLA
	NMPA	EMA, TGA, FDA	NMPA	EMA, TGA, FDA
低pH	2种病毒（MULV, PRV），2批次，动态曲线	1种病毒（MuLV），1批GMP批次，重复两次	与FDA相同，只是需要3批次	2种病毒（MuLV, PRV），重复两次
纳滤	2种病毒（MVM, Reo-3），3 批次，流程内的测试	2种病毒（MuLV, MVM），1批GMP批次，重复两次，MVM需要流程内测试	与FDA相同，只是需要3批次	4种病毒（MuLV, MVM, Reo-3, PRV），重复两次，MVM需要流程内测试
层析1	N/A	2种病毒（MuLV, MVM），1批GMP批次，重复两次	与FDA相同，只是需要3批次	4种病毒（MuLV, MVM, Reo-3, PRV），重复两次，评估树脂的最大循环
层析2	N/A	另一个层析选择	与FDA相同，只是需要3批次	4种病毒（MuLV, MVM, Reo-3, PRV），重复两次，评估树脂的最大循环

 

①指示病毒的差异

 

病毒清除研究中的一个主要问题是确定使用何种病毒。这些病毒可分为三类:“相关”病毒、特异“模型”病毒和非特异“模型”病毒。“相关”病毒是指用于生产过程中评价病毒清除情况的病毒，可以是已被鉴定的病毒，或是与已知病毒种类相同的病毒，或是可能会污染细胞培养物或污染生产过程中使用的其他试剂或材料的病毒。如果得不到“相关”病毒，或它不太适用于清除病毒的工艺评价研究(如不能离体培养到足够的滴度)，应使用特异“模型”病毒代替。

 

国外法规虽没有做出具体的要求，但是要求尽可能选择污染产品最相似的病毒进行验证，即特异性指示病毒；同时也需要关注具有广泛理化性质的非特异性病毒。

 

而中国的病毒安全性评价指导原则要求比较详细具体，明确指出了清除验证中所应使用病毒的类型。法规要求：“一个典型的验证研究所选择的病毒，至少应包括单链和双链的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、强和弱抵抗力、大和小颗粒等病毒；去除/灭活技术方面可根据采用的具体方法选择恰当的适宜病毒。”

 

当然，关于如何指示病毒的核心需要以在整个生产过程中可能出现的污染病毒为主，并且结合能够用于评价验证效果的指示病毒的可获得性与相关培养试验条件进行合理设计。

 

②工艺选择差异，效果要求略有不同

 

根据表四可知，中国国内IND申报时，一般选择低pH（或者有机溶剂/去污剂(S/D)）和膜过滤这两个工艺。国外进行IND申报时，除了选择以上这两个工艺外，还需加一个层析工艺（如果还是达不到要求，还需再加一步层析）。

 

生物制品工艺验证与研究中，需要针对以上对病毒具有去除或灭活效果的纯化步骤进行充分的验证，根据研究的结果评价整体工艺对病毒安全性的防控效果。

 

③重复性差异

 

中国国内的指导原则虽然没有硬性的规定，但通常需要做三个批次（GMP或non-GMP都可以）。在ICH法规中，明确指出至少分别做两次独立的研究来证实清除的可重复性，因此一般是一批样品（一般要求GMP）重复两次。

 

总结与讨论

 

病毒安全性评价是生物制品生产中的一项重要的研究项目。病毒安全性评价包括病毒检测和病毒灭活/去除两大块项目，其中病毒检测包括细胞库（PCB/MCB/WCB/EOPC）病毒检定和UPB病毒检测。关于病毒安全性评估，每个国家都有自己相关的法规和指导原则。由于这种原因使得我们国内的很多生物制药企业对于国外申报或者中外申报“望而却步”。

由于病毒安全性评价各国所参照的法规不一致，其关于细胞库检定中病毒检测方面，可以看出中外申报虽然各方面检测要求比较一致，但是还是有差异的。例如，在牛源性病毒和猪源性病毒方面，所参照的法规不一致，所要检测的病毒也不一致；在抗体产生试验检测部分，所要检测的病毒也是不一致的；在细胞库检定类型方面，国外IND申报不要求对EOPC进行检定。在病毒清除研究方面中外申报的要求也是存在许多不同的，包括指示病毒选择、工艺步骤选择以及重复性方面。

随着中国加入并成为ICH管理委员会成员，NMPA的法规逐渐与ICH接轨，技术指导原则等也越来越向其靠拢。2020年1月21日NMPA发出公告，自2020年7月10日开始的国内申报材料中药学研究部分关于病毒安全性评价及方法验证，适用于ICH Q5A(R1)和ICHQ5B指导原则。这也就是说，在2020年7月10日之后，我们如果需要进行中外申报可以按照国际申报的要求，寻求遵循GMP的合格第三方检测机构来进行相关的研究。按照国外申报要求进行细胞库病毒检测，在国内申报也是可行的；并且在以后的病毒清除研究中，我们也许可以真正的只采用一批GMP批次并按照国际申报的要求进行研究，就可以满足中外双报的要求。这无疑是给我们国内的生物制药企业打了一针“强心剂”，使越来越多制药企业选择中美双报或多国多报，从而加速药品上市。

 

后记

 

病毒安全性评价是生物制品生产过程中极其重要的一项，在生物制品细胞库建立和生产工艺里应该重点考虑和设计的步骤。但是由于各国相关的指导原则和法规的不同，导致了国内许多中外双报的生物制药企业在病毒安全性评价方面寻找不到合格的服务供应商。中国NMPA公告开始适用于ICH法规（ICH Q5A和ICH Q5B），这也明示这按照国外申报的要求进行研究也是符合中国国内的申报要求。

来源：Internet

关键词： 病毒安全性评价