几乎任何HPLC方法优化的目的都是追求在最短的时间内实现最大的分离。这种优化可以让我们获得更好的数据，也让分析的运行成本和耗费时间更低。为了达到这个目的，色谱工作者需要基于对HPLC基础知识的理解快速设计方法。如下三个建议可以为HPLC方法的开发提供一个好的起点。

 

1. 考虑分析物的化学性质

 

分析物通过与HPLC固定相和流动相的相互作用而实现保留，如果没有这些相互作用，就不会实现分离目标。因此，你的分析物的化学性质会影响到你方法开发的全过程，包括色谱柱选择和流动相设计。特别重要的是你的分析物的极性，比如纯粹的非极性分析物适合在反相HPLC模式下选择疏水性固定相（如C18，C8和phenyl等）来保留和分离；极性或者可离子化的分析物需要更极性的固定相，比如氰基或者氨基，或者甚至选择一种不同的色谱模式，比如亲水作用色谱（HILIC），正相或者混合模式来实现分离。对于可离子化的分析物，当它们处于电离状态时是很难用常用的反相HPLC来保留的，因此很有必要调节流动相pH值而使这些化合物呈中性状态来获得更好的保留以及避免峰形问题（比如碱性化合物的拖尾）。在设计流动相时，获取分析物的pKa方面的信息是极其重要的，流动相的pH应该比分析物的pKa高或者低2个单位（取决于分析物是酸性还是碱性，对于酸性是低2个单位，对于碱性化合物是高2个单位）以使分析物呈中性。筛选一定范围的pH并评估它对保留和分离的影响是非常有效的操作。

 

2. 优化选择性

 

在所有影响分离度的色谱参数中，选择性是影响最大的因素（如图1）。每个因素（选择性，保留率，柱效）都能通过改变特定的方法的参数来调节，比如流动相组成，温度或者柱内径。然而，色谱柱固定相是影响选择性最大的因素。因此，第二大方法开发的建议是筛选具有不同固定相化学的色谱柱。这种方法有几个好处，包括快速发现适合你的分析物分离的最佳固定相以及正交（互补）的固定相筛选可以让你发现潜在的杂质峰，而如果只是筛选相似的固定相（比如不同品牌的C18柱），这些杂质峰可能就不会被发现。其他影响选择性的参数有流动相的有机溶剂，流动相pH，流动相添加剂和温度。

 

图1 三个色谱参数对分离度的影响

 

3. 使用探索性梯度（Scouting Gradient）

 

一个探索性梯度是一种线性的梯度：在一个设定的时间里，从5-10% B到100% B（20 min是一个标准时间）。在100% B的洗脱强度处维持几分钟，以确保所有的成分都已经被洗脱出来。对于反相梯度洗脱，水（或者缓冲液，如存在可离子化分析物）和乙腈是最典型的洗脱液选择。使用挥发性缓冲液（比如甲酸铵）会使得方法兼容LC-MS中的质谱检测器。获得的色谱图可以揭示关于流动相组成、色谱柱化学以及分离需要的分析模式的很多信息。如果化合物在大于梯度时间的25%洗脱出来，那么这个分析方法需要洗脱更强的B相或者更小保留的色谱柱。另外，下面的方程式（tg表示探索性梯度时间）可以被用于决定是否等度分离是可能的，毕竟等度方法由于可以简化分析以及获得更高的样品通量而更受欢迎。

 

 

当建立的方法为梯度方法时，第一个峰洗脱出来的流动相组成应该被用于起始流动相组成。

 

本文翻译自LCGC Europe Volume 32, Issue 11, pg 619，Top Three HPLC Method Development Tips，作者：LCGC's CHROMacademy

原文网址：

http://www.chromatographyonline.com/top-three-hplc-method-development-tips

 

 

来源：爱色谱

关键词： HPLC