多肽纯化过程中，氧化杂质（如甲硫氨酸、半胱氨酸等氨基酸的氧化产物）是常见的副产物，其结构与目标多肽高度相似，但电荷、疏水性或分子构象存在差异。通过合理筛选流动相组成，可调控多肽与杂质在色谱柱中的保留行为，从而实现高效分离。以下是基于理论及实验优化的流动相选择策略：

 

一、氧化杂质的特性与分离需求

氧化杂质主要包括：

甲硫氨酸氧化产物（如甲硫氨酸亚砜、砜），其极性增强，疏水性降低。

半胱氨酸氧化产物（如二硫键错误配对或游离巯基氧化为磺酸基），改变电荷状态及分子构象。

色氨酸氧化产物（如羟基色氨酸），紫外吸收特性改变，可能干扰检测。

这些杂质与目标多肽的差异主要体现在电荷分布、疏水性及分子大小上，需通过流动相参数调整放大差异，提升分离选择性。

 

二、流动相关键参数对氧化杂质分离的影响

1. pH值的调控

电荷差异利用：通过调节pH接近目标多肽的等电点（pI），可抑制其解离，增强疏水作用；而氧化杂质因电荷状态改变（如羧基或氨基氧化）可能偏离pI，从而在反相色谱（RPC）中呈现不同保留行为。

示例：若目标多肽pI为5.0，而氧化杂质因新增羧基导致pI降低至4.0，选择pH 5.0的流动相可使目标多肽呈电中性（疏水性强），而氧化杂质带负电（疏水性弱），实现分离。

稳定性考量：避免极端pH（如pH >8.0）导致半胱氨酸等敏感氨基酸进一步氧化，建议使用弱酸性缓冲体系（pH 2.0-6.0）。

2. 有机溶剂类型与比例

乙腈与甲醇的选择：乙腈洗脱能力较强且黏度低，适用于疏水性差异显著的氧化杂质分离；甲醇极性更高，适合极性氧化产物（如甲硫氨酸亚砜）的洗脱。

梯度优化：采用分段梯度洗脱（如初始低乙腈比例保留目标多肽，逐步提高比例洗脱疏水性较弱的氧化杂质）。

添加剂作用：加入0.1%三氟乙酸（TFA）可形成离子对，增强带正电多肽的疏水保留，而氧化杂质可能因电荷改变减少与TFA的相互作用，从而缩短保留时间。

3. 抗氧化剂与离子对试剂

抗氧化保护：针对含半胱氨酸的多肽，流动相中需添加还原剂（如1-5 mM二硫苏糖醇DTT或三(2-羧乙基)膦TCEP），防止氧化杂质生成。

离子对试剂选择：对强极性氧化杂质（如磺酸化产物），使用阴离子型离子对试剂（如庚烷磺酸钠）可增强其与固定相的疏水作用，延长保留时间。

4. 缓冲盐与离子强度

缓冲体系稳定性：醋酸盐或磷酸盐缓冲液（pH 3.0-5.0）可维持氧化敏感多肽的稳定性，同时通过调节离子强度影响静电相互作用。

示例：在离子交换色谱中，氧化杂质可能因电荷密度差异，需通过梯度盐浓度（如0-500 mM NaCl）实现洗脱。

 

三、色谱柱与操作条件的匹配

固定相选择：

反相色谱柱：C18适用于疏水性多肽，而氧化杂质因极性增强可能优先在C8或苯基柱上分离。

孔径与粒径：大孔径（300 Å）色谱柱可容纳氧化导致的构象变化多肽，小粒径（3 μm）填料提升分离度。

温度控制：

低温（如4°C）可减缓氧化反应，但可能增加流动相黏度；高温（如30°C）可改善峰形，但需权衡氧化风险。

 

四、应用实例与优化策略

案例1：含半胱氨酸多肽的纯化

问题：目标多肽含游离半胱氨酸，易氧化为二硫键杂质。

方案：流动相中添加5 mM TCEP，pH 4.0（醋酸缓冲液），乙腈梯度从25%升至40%，C18柱分离，主峰纯度从70%提升至95%。

案例2：甲硫氨酸氧化杂质的去除

问题：甲硫氨酸氧化为亚砜后极性增加，与目标多肽共洗脱。

方案：采用pH 5.0（磷酸盐缓冲液）及10 mM庚烷磺酸钠，乙腈梯度延长至15分钟，成功分离氧化杂质。

 

五、总结与展望

针对氧化杂质的流动相优化需综合多肽特性、杂质类型及分离目标，通过pH调控、有机溶剂梯度、抗氧化剂联用等手段实现高效分离。未来可结合质谱在线检测技术，实时监控氧化杂质分布，进一步提升纯化工艺的智能化水平。

 

 

来源：药事纵横

关键词： 多肽纯化 流动相选择