嘉峪检测网 2025-05-19 20:08
导读：建立高效液相色谱法测定化妆品原料三肽-1铜（GHK-Cu），进而考察原料的高温及光照稳定性。
摘 要：建立高效液相色谱法测定化妆品原料三肽-1铜（GHK-Cu），进而考察原料的高温及光照稳定性。以0.1%三氟乙酸溶液为溶剂溶解样品，经CAPCELL PAK ADME C18色谱柱分离，流动相为0.1%三氟乙酸溶液，等度洗脱，流量为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，采用DAD检测器测定，检测波长为217 nm，进样体积为10 μL，以色谱峰面积外标法定量。三肽-1的质量浓度在0.937 5～93.75 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 9， GHK-Cu的检出限为1.1 ng，定量限为3.3 ng。样品加标回收率为100.2%～102.1%，测定结果的相对标准偏差为0.58%（n=9）。该方法能够满足三肽-1铜的快速、准确测定要求。
关键词：三肽-1铜；高效液相色谱法；化妆品原料
近年来，随着国家政策的扶持及电商的猛然崛起，我国化妆品行业发展势头锐不可挡，其中，具有抗衰功效的功效性化妆品备受消费者青睐。三肽-1铜(GHK-Cu)能安全有效地作用于人体皮肤及毛发，直接帮助胶原蛋白及糖胺聚糖的合成，具有优异的抗衰老作用[
GHK能促进大鼠肝细胞的存活率和肝癌细胞的生长，影响细胞的转录和翻译过程，因此被称作肝细胞的生长因子[
GHK-Cu原料因其合成工艺的不同而质量参差不齐，亟需一种快速简便的检测方法来定量。目前针对GHK-Cu的报道多为合成纯化及药理作用研究，相关检测方法报道较少。目前仅检索到两篇中文文献，报道了采用液相色谱法测定GHK-Cu[
1.实验部分
1.1主要仪器与试剂
高效液相色谱仪：LC-20AT型，日本岛津实验岛器材有限公司。
超纯水机：Milli-Q型，美国密理博公司。
电子天平：MS105DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
数控超声仪：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。
紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用公司。
三肽-1标准品：质量分数为85.0%，批号为20201104，山东济肽生物科技有限公司。
磷酸氢二钠、磷酸二氢钾：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
三氟乙酸：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司。
实验用水为超纯水，由Milli-Q超纯水机制备。
待测样品：由济肽生物有限公司提供。
1.2色谱条件
色谱柱：CAPCELL PAK ADME C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，资生堂(中国)投资有限公司]；流动相：0.1%三氟乙酸溶液；流量：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；检测器：DAD检测器；检测波长：217 nm；柱温：30 ℃。
1.3溶液配制
对照品储备液：1.875 mg/mL，精密称定三肽-1标准品110.32 mg，置于50 mL容量瓶中，加入0.1%三氟乙酸溶液，超声溶解后定容至标线，摇匀。
系列标准工作溶液：三肽-1质量浓度分别为0.938、4.688、9.375、18.75、46.88、93.75 μg/mL。分别准确移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL对照品储备液至6只100 mL容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液稀释定容至标线，混匀。
样品溶液：取混匀的样品约20 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加入0.1%三氟乙酸溶液，超声溶解后定容至标线，摇匀，作为样品溶液。
空白样品溶液：用不含三肽-1铜的空白样品，按样品溶液制备方法制备空白样品溶液。
1.4测定方法
取系列标准工作溶液和样品溶液，在1.2仪器工作条件下进样分析，计算色谱峰面积，以系列标准工作溶液中目标物的质量浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，按外标法计算样品中目标物的含量。
2.结果与讨论
2.1检测波长选择
精密吸取三肽-1对照品储备液适量，加水稀释，配制成含三肽-1的质量浓度为100 μg/mL的溶液，以水为空白溶剂校对零点，用紫外分光光度计，在190～400 nm 波长范围内对该溶液进行扫描，结果如图1所示。由图1可以看出，三肽-1在217 nm处吸光度最大，故选择检测波长为217 nm。
图1三肽-1紫外吸收光谱图Fig. 1UV absorption spectrum of Tripeptide-1
2.2色谱柱选择
三肽-1铜分子极性较大，在一般流动相和色谱柱中很难保留。分别考察普通C18柱和CAPCELL PAK ADME C18柱对三肽-1的保留行为。结果表明，普通C18柱对三肽-1保留效果及色谱峰形均较差；键合了笼状结构金刚烷胺基团的CAPCELL PAK ADME C18柱，在保持填料疏水性的同时，提高了表面极性，有助于提高强极性化合物的分离效果，延长了三肽-1的保留时间且色谱峰形良好，因此选择CAPCELL PAK ADME C18色谱柱进行分离。
2.3流动相选择
CAPCELL PAK ADME C18色谱柱可以在100%水相条件下使用，先采用磷酸盐缓冲液作为流动相等度洗脱，考察不同pH值下GHK-Cu的出峰情况。结果显示，pH值小于6或大于7时色谱峰形分叉，pH值为6～7时可得到单一色谱峰，但峰形较宽、较差，存在干扰，不利于定量。
采用体积分数为0.1%的三氟乙酸溶液(pH值约为2.0)作为流动相等度洗脱，考察GHK-Cu的分离效果。结果显示，GHK-Cu完全解离为GHK和Cu2+，且GHK和Cu2+的色谱峰形及分离度均较好，能准确定量GHK-Cu并确定二者比例，因此选择0.1%三氟乙酸溶液为流动相。
2.4专属性试验
在1.2色谱条件下，分别测定空白样品溶液、标准溶液、样品溶液，考查方法的专属性及系统适用性，结果如图2所示。由图2中可以看出，在该色谱条件下，GHK-Cu及杂质可以实现完全分离，分离度大于1.5，理论塔板数大于4 000。
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图2空白样品溶液、标准溶液和样品溶液色谱图
Fig. 2Chromatograms of blank solution，standard solution and
sample solution
2.5线性方程、检出限和定量限
在1.2仪器工作条件下，对系列标准工作溶液进行测定，以目标物的质量浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果表明，
GHK的质量浓度在0.937 5～93.75 μg/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，线性方程为y=8 344.90x+610.529，相关系数为0.999 9。
取系列标准工作溶液中最低质量浓度点的溶液，用水逐级稀释后测定，分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限和定量限，得该方法的检出限为0.093 8 μg/mL，定量限为0.281 4 μg/mL。当进样体积为10 μL时，GHK的检出限为0.938 ng，定量限为2.814 ng。GHK-Cu中GHK与Cu2+是1∶1结合，换算成GHK-Cu的检出限为1.1 ng，定量限为3.3 ng。
2.6加标回收与精密度试验
取约12 mg样品，精密称定，置于100 mL 容量瓶中，平行称取9份，加入不同质量的三肽-1，进行高、中、低3个水平的加标回收试验。按1.3方法制备加标样品溶液，在1.2仪器工作条件下测定，计算回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表1。由表1可知，三肽-1的加标平均回收率为101.4%，测定结果的相对标准偏差为0.58%。表明该方法准确性和精密度良好。
表1样品加标回收与精密度试验结果
Tab. 1Results of sample spiked recovery and precision test
2.7溶液稳定性试验
按1.3方法制备样品溶液，分别在第0、2、4、8、12、24h进样测定，结果见表2。由表2可知，三肽-1色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.03%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。
表2样品溶液稳定性试验结果
Tab. 2The stability test results of sample solution
2.8样品热稳定性及光照稳定性试验
取某厂家提供的蓝色晶体原料，置于40 ℃烘箱中保存，分别在第7、28、84 d测定GHK-Cu的含量并与初始含量比较，考察其热稳定性；将原料置于照度为4 500 lx的光照箱内，分别于第7、28、84 d测定GHK-Cu的含量并与初始含量比较，考察其光照稳定性，结果见表3。由表3可知，经84 d的热稳定性和光照稳定性试验，样品中GHK-Cu的质量分数分别为初始值的96.2%、95.7%，表明在84 d内该蓝色晶体原料稳定性良好，能够满足后续化妆品制剂调配的要求。
表3样品热稳定性及光照稳定性试验结果
Tab. 3Results of thermal stability and light stability test
3.结语
建立了高效液相色谱测定化妆品原料GHK-Cu含量的方法。该方法简捷、准确、高效，解决了GHK-Cu质量控制及优劣评价方法缺失的难题，可为化妆品原料GHK-Cu的质量控制提供技术保障。
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LIN Yujia,YU Haiying,DIAO Feiyan,ZHANG Liangyu,WANG Weijian,LI Qiyan
（Shandong Institute for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Evaluation of Cosmetic Raw Materials,Jinan Engineering Research Center for Cosmetics of Specialty Plant Resources, Industrial Technology Foundation Public Service Platform, Jinan 250101, China）
Abstract:A method for the determination of cosmetics raw materials copper tripeptide-1 (GHK-Cu) by high performance liquid chromatography was established, and to investigate its high temperature and light stability. After dissolving in 0.1% trifluoroacetic acid solution, the samples were separated by CAPCELL PAK ADME C18column. 0.1% trifluoroacetic acid solution was used as the mobile phase with isocratic elution, the flow rate was 1.0 mL/min, and the column temperature was 30 ℃. The samples were determined by DAD detector, the detection wavelength was 217 nm, and the sample volume was 10 μL. Quantify by chromatographic peak area external standard method. The mass concentration of tripeptide-1 had a good linear relationship with the chromatographic peak area in the range of 0.937 5-93.75 μg/mL, and the correlation coefficient was 0.999 9. The detection limit of GHK-Cu was 1.1 ng, and the quantification limit was 3.3 ng. The recoveries of samples spiked were 100.2%-102.1%, and the relative standard deviation of the measurement results was 0.58% (n=9). This method can meet the requirements of rapid and accurate determination of copper tripeptide-1.
Keywords:copper tripeptide-1；high performance liquid chromatography；raw materials of cosmetics
引用本文：林钰镓，于海英，刁飞燕，等 . 高效液相色谱法测定化妆品原料三肽-1铜［J］. 化学分析计量，2025，34（1）： 71.(LIN Yujia, YU Haiying, DIAO Feiyan, et al. Determination of cosmetics raw materials copper tripeptide-1 by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 71.)
来源：化学分析计量
关键词： 化妆品
