一、回收率试验的核心目标与科学要求

 

回收率试验的本质是评估分析方法的准确度（Accuracy），即测定值与被测物真实值的接近程度。其核心要求在于：

1、覆盖预期范围：药品实际检测中，样品浓度通常存在合理波动范围（如制剂含量测定通常关注标示量的90%-110%或95%-105%）。方法必须在此整个声明范围内均能提供准确结果。

2、识别系统偏差：需识别是否存在随浓度变化的系统性偏差（浓度依赖性偏差），例如低浓度下提取效率下降、高浓度下基质效应增强等。

3、评估精密度：在评价准确度的同时，也需考察方法在相关浓度点的精密度（重复性），这一点在2025版药典9101中已被明确指出“准确度和精密度可以分别评估，也可以使用联合验证的方式评估”。

 

二、 1×6模式评估的便利性与局限性

 

1×6模式（单一浓度6份样品）首先具备便利性，实际研究中具备低成本的优势（如方案制定简便、实验操作简单），其主要局限性在于其空间维度上的信息缺失：

1、单点验证，范围失察：该方法仅能提供目标浓度点（通常是100%）下的准确度和精密度信息。它无法证明方法在范围两端（如80%或120%）的性能。实际样品可能因生产工艺波动、储存降解等原因偏离目标值，若方法在临界浓度点存在显著偏差，将导致误判风险。

2、浓度依赖性偏差失察：分析过程中潜在的浓度依赖性偏差（如非线性响应、不同浓度下基质干扰程度差异）在此设计中完全无法被检测。一个在100%浓度回收率良好的方法，可能在80%浓度下回收率偏低，或在120%浓度下回收率偏高，而1×6设计对此无解。

3、统计意义不充分：虽然n=6能提供该浓度点下更窄的置信区间和更可靠的重复性标准差估计（相对于n=3），但这仅提升了该单点的精密度评估力度，并未解决对方法在整个工作范围内准确度评估不足的根本缺陷。该点精密度高不代表在非测试浓度点也准确，更无法实现准确度和精密度联合评价的目的。

 

三、 3×3模式科学覆盖研究范围

 

低、中、高三个浓度（通常为目标浓度的80%、100%、120%）各3份样品（3×3模式）的设计，其科学性体现在以下几方面：

1、范围覆盖全面性：明确覆盖了分析方法预期使用的关键浓度范围（80%-120%）。通过评估三个离散点，能有效推断方法在此区间内的整体性能，符合“范围（Range）”可报告上下限的验证要求。

2、检测浓度依赖性偏差：通过比较三个浓度水平的平均回收率及其变化趋势，可以直观判断是否存在系统性偏差随浓度变化的现象。例如，若低、中、高浓度回收率呈单调递增或递减趋势，则强烈提示存在浓度依赖性干扰或方法线性问题（注此处线性问题指的是基质存在下的线性问题，一般方法学验证线性研究中会忽略该问题），需进一步调查优化。

3、全面评估精密度：该设计不仅提供了每个浓度点（n=3）的初步精密度信息，更重要的是，通过不同浓度点的结果，可以评估精密度是否随浓度变化（如相对标准偏差RSD的一致性）。总样本量（n=9）与1×6模式（n=6）相近，但获取的信息维度显著增加。

4、符合国际规范与科学共识：主要指南均明确推荐或要求采用覆盖范围的多浓度设计：

ICH Q2(R1): “准确度需要在可报告范围内，使用各浓度水平适当数量的平行样品进行评估（如：按完整分析方法在3个浓度各重复测定3次）”。

USP <1225>: “The ICH documents recommend that accuracy should be assessed using a minimum of nine determinations over a minimum of three concentration levels, covering the specified range(i.e., three concentrations and three replicates of each concentration)”，可见USP遵循了ICH的建议，即推荐3×3模式。

 

四、1×6模式的有限适用场景

 

必须承认，1×6模式并非毫无价值，其适用场景有限且需论证：

1、高度特异性的单一浓度检测：当方法严格限定用于检测不变浓度的样品。

2、方法开发初期的筛选：在优化阶段对特定浓度点进行初步效能评估。

3、验证后的补充：在完成3×3模式验证且结果满意后，若对目标浓度（100%）的精密度有极高要求，可额外增加该浓度的测定次数（如再加3份）。

综上所述，在分析方法验证的回收率（准确度）试验中，3×3模式（三个浓度各三份）在科学性上显著优于1×6模式（单一浓度六份）。其核心优势在于能够有效覆盖方法的预期工作范围，检测潜在的浓度依赖性系统偏差，从而全面评价方法的准确度性能。这不仅是科学严谨性的内在要求，也是全球药品监管机构（ICH, FDA, EMA, NMPA等）和药典标准（USP, ChP）的明确规定。采用3×3设计是确保药品质量控制数据可靠、保障公众用药安全的基石。而1×6模式因其固有的范围评估缺陷，不应作为回收率试验优先验证方案。