摘 要 / Abstract
蛋白质组学研究是继基因组学研究兴起之后的又一新兴领域，为相关科学研究提供了全新的思路和技术，已在药品和生物制品领域得到了广泛应用。近年来，蛋白质组学技术开始逐渐被应用于食品和化妆品检测领域，有望为开展食品和化妆品安全、质量控制等研究提供有力手段。本文主要综述了已应用蛋白质组学技术进行研究的食品和化妆品种类，并介绍其技术流程特点，对分析流程中亟待解决的技术难点进行了剖析。蛋白质组学技术具有其他传统方法不可取代的高准确性、高通量的检测优势，同时需要注意，其在食品和化妆品检测领域的方法回收率低、标准物质研制滞后等主要问题仍有待克服。
Proteomics research, emerging after the rise of genomics, provides new ideas and techniques for related scientific research and has found ample applications in drugs and biological products. In recent years, proteomic techniques have gradually been applied to the field of food and cosmetics detection, offering a powerful means for research on the safety and quality control of these products. This paper reviews the types of foods and cosmetics studied using proteomics techniques, introduces the characteristics of their technical processes, and analyzes the technical difficulties in the analysis process. Proteomics technique boasts high accuracy and throughput, which are irreplaceable compared to traditional methods. However, challenges such as low method recovery and the lagging development of reference materials still need to be overcome in the field of food and cosmetics detection.
关 键 词 / Key words
蛋白质组学；食品；化妆品; 高准确性；高通量
proteomics; food; cosmetics; high accuracy; high throughput
食品安全是人类面临的一个重大挑战，人们对食品的关注已经不仅仅局限于其营养价值，还越来越重视其安全性。如何全面评价食品质量，实现对食品质量全过程的把控颇为重要[1]。我国《食品安全法》[2] 的实施为国内食品安全提供了有力保障。食品质量受原材料、生产加工、储存运输等多种因素的影响，相关质量问题包括含有传统的化学危害物、致病菌，以及以次充好、以劣质原材料生产高价值产品、产地造假等[3-6]。
随着人们生活质量的提高，化妆品日渐成为生活必需品。根据中国香料香精化妆品工业协会不完全统计，2020 年我国化妆品生产企业主营业务收入达3950亿元[7]。随着化妆品生产工艺的发展和销量的高速增长，产品质量和安全受到越来越多的关注。同时，随着更多化妆品新材料被发现，如蛋白质和多肽类物质，在提高产品质量和功效的同时，相关安全问题也在增加[8]。为保障化妆品质量，加强化妆品质量安全监管，我国发布了《化妆品安全技术规范（2015 年版）》[9]，明确了化妆品禁限用组分。
蛋白质分别作为主要营养成分和新型化妆品材料存在于食品和相关化妆品中，参与决定了食品和化妆品质量。传统的蛋白质研究方法有酶联免疫吸附测定法（ELISA 法）、Folin- 酚试剂法（也称为Lowry 法）、考马斯亮蓝法（Braford 法）和凯氏定氮法等[10-12]。上述方法只能用于总蛋白含量测定，无法对具体的营养蛋白或者过敏原进行定性定量检测，且研究通量低，具有局限性。蛋白质组学是继基因组学研究兴起之后的又一新兴领域，与传统蛋白质研究方法相比，能够用于蛋白质的鉴定、定量、定位、蛋白结构修饰分析和蛋白质- 蛋白质相互作用研究[13-15]，且研究通量高， 研究范围更加完整。因此，蛋白质组学技术为相关科学研究提供了全新的思路和技术，已在药品和生物制品领域得到广泛应用[16-17]。近年来，蛋白质组学逐渐被应用于食品和化妆品等领域，如品质评价、风险发现、产品真实性检验、产品掺杂掺假检测和产品功效评价等[18-19]，其在食品和化妆品领域的应用范围和解决问题如表1 所示。
1、蛋白质组学技术介绍
经过数十年的发展，基于质谱的蛋白质组学技术已形成了一套较为完整的分析流程，常规分析步骤主要包括：样品前处理、分离、质谱检测和质谱数据分析。其中，样品前处理是整个蛋白质组学分析流程中的关键步骤，影响分析稳定性、准确性和灵敏度[20]。传统的样品制备方法步骤多、耗时长，且大部分依靠手工操作，不可避免地存在人为误差。值得关注的是，自动化样品制备平台的相继出现，如贝尔曼库尔特的Biomek® NXP 自动化工作站[21]和赛默飞的全自动磁珠提取纯化系统KingFisher Flex 等， 有助于提高生物标志物候选物的通量和可重现的定量，在临床、药品和生物制品领域已经有所应用[22-23]。需要注意的是，在食品样品制备领域，高通量样品制备技术尚未得到应用，大多仍依靠手工操作，其步骤烦琐、样品回收率偏低，有待进一步优化。
2、蛋白质组学技术在食品质量检测领域的应用
蛋白质组学技术的发展为食品相关研究打开了新思路，不仅可以用于蛋白质种类鉴定，还可用于蛋白质含量检测，以及分析不同物种、产地、生长阶段的食品蛋白质组分和食品加工过程蛋白质组变化等。目前，蛋白质组学技术已在食品的诸多品类中有应用，如农产品、海产品、乳制品、肉类、微生物类以及食品过敏原等（表2）。
蛋白质组学中基于质谱的分析方法是食品质量分析领域中发展较快的方法， 研究流程分为Bottom-up 型和Top-down型。前者又称为鸟枪法，该技术流程一般分为以下几步：样品制备，即从样品中分离净化目标物；蛋白质酶解，将蛋白质酶解为肽段；利用色谱技术对肽段进行分离，随后进入质谱检测。相较于Bottom-up 技术，Top-down 技术的不同之处在于蛋白质未经酶解直接进入质谱，直接被裂解为肽段进行分析。该方法成本高，目前应用较少。蛋白质组学分析流程见图1。
3、蛋白质组学技术在化妆品质量检测领域的应用
蛋白质和多肽类原料在化妆品生产中的应用日益增多，如胶原蛋白、蚕丝蛋白、牛奶提取蛋白、弹性蛋白、角蛋白、小麦水解蛋白等在各类化妆品中已有应用。我国《已使用化妆品原料目录（2021 年版）》[42] 中属于蛋白质类和肽类的相关原料已有213种。蛋白质类原料的应用可以使化妆品具有抗衰老、美白、保湿等功效[43]，故该类原料已成为各大化妆品品牌的竞争亮点和开展基础研究的重点关注对象。但由于有些内源性蛋白质或多肽具有相对较高的生物活性，可能具有致敏性，实际应用过程中应予以重点关注[44]。笔者查阅国内外相关文献发现，当前已有基于质谱的蛋白质组学技术应用于化妆品中常见蛋白质原料检测方面的研究，但对于实际化妆品样品中蛋白质应用检测的蛋白组学技术研究尚未有报道。
3.1 化妆品中动物来源蛋白质原料的分析特点
目前， 应用于化妆品的蛋白质类和肽类原料已有213 种，其中常用的动物来源蛋白质主要有胶原蛋白、角蛋白、骨胶原、胎盘蛋白（ 动物）、弹性蛋白、牛奶蛋白等。该类原料的使用对皮肤具有一定功能性作用， 在化妆品中应用广泛。然而， 一些不法商家夸大宣称或不恰当宣传其功效，从而误导消费者。此外，该类原料价格相对较高，部分原料对储存条件有一定要求。因此， 应当对该类原料使用的合规性多加关注， 如实际产品与配方的一致性、原料的保管和来源等。
胶原蛋白是最常用于化妆品的动物来源蛋白质原料，因其具有保湿、再生和成膜特性，有助于皮肤保持适当的水分含量，从而滋润和软化皮肤，还可防止机械损伤引起的皮肤和头发损伤[45]。因此，胶原蛋白被广泛应用于美容领域。目前，胶原蛋白主要从哺乳动物和鱼皮中提取[46]，但哺乳动物来源的胶原蛋白具有疾病传染风险，鱼皮中提取的胶原蛋白则具有独特的应用优势。研究表明，海洋胶原蛋白中富含Ⅰ型胶原蛋白[47]，人皮肤中主要的胶原蛋白类型也是Ⅰ型[48]，且没有疾病传播风险，是化妆品领域较为理想的胶原蛋白。因此，有必要针对相关产品中的胶原蛋白类型及来源进行检测。例如，有研究者利用离子阱质谱仪鉴定Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的标记肽，使用三重四极杆质谱仪进行含量测定[49]。还有研究者使用快速简便的液相色谱- 串联质谱法（LC-MS/MS）鉴定胶原蛋白标记肽，该方法可以同时检测6 种动物来源的胶原蛋白[50]。总之，对于化妆品中的动物来源蛋白质原料，注重分析其来源和类型。
3.2 化妆品中植物来源蛋白质原料的分析特点
植物蛋白对人体的皮肤具有较好的亲和力，可以提高表皮保湿性能，同时具有成膜性[51]。植物蛋白含人体8 种必需氨基酸，能促进表皮生长发育、修复组织、抗衰老、去角质等。植物来源的蛋白质类和肽类原料主要用于皮肤或头发调理剂等个人护理产品。应用于化妆品的植物蛋白主要分为2 种：植物蛋白水解物和水解物的衍生物。其中，水解植物蛋白在个人护理产品中的用途报道最多， 共有140 余种配方，约有一半用于免洗产品，且涉及种类繁多，如大豆蛋白、小麦蛋白、燕麦蛋白、杏仁提取蛋白、玉米蛋白及其水解蛋白等[52]。值得关注的是，欧盟委员会已经对欧盟化妆品法规（EC）No.1223/2009 中的“化妆品限用物质清单”（附录Ⅲ）进行了修订，限制了花生油和水解小麦蛋白在化妆品中的使用，规定化妆品中使用的花生油提取物或衍生物的蛋白最大浓度设定为0.5μg/ml，水解小麦蛋白中多肽的最大分子量平均值限制为3.5kDa[53]。总之，对化妆品中植物来源的蛋白质类和肽类原料的关注重点是对具有生物活性的该类原料进行鉴定及含量检测。
有研究者利用质谱法对玉米酒糟的蛋白水解物进行分析鉴定，鉴定出APLA、PLFP、LFLP、LPPYL、PLYPLP、NDWHTGPL、LPPYLPS、GSPFLGQ、SWQQPIVGG 等多个抗氧化活性肽[54]。也有研究者通过使用质谱法确定了3 个表型组（WDEIA、AD、PR）的特定致敏谱，并通过LC-MS/MS 确定了几种小麦过敏原[55]。还有研究者开发了一种外标肽段定量的高灵敏LCMS/MS 检测方法，用于定量分析大豆样品中Gly m 5.0101 的含量， 通过对Gly m 5.0101 的特异性标记肽NPFLFGSNR 定量，检测各种大豆种子和豆粕中的痕量Gly m 5.0101[56]。
4、蛋白质组学技术用于食品和化妆品检测相关研究面临的问题与建议
4.1 研究开发过程中的问题与建议
基于质谱的蛋白质组学技术发展至今，从样品制备、蛋白质组质谱数据采集到质谱数据分析都取得了快速发展。其中，样品制备是相关工作流程中的关键步骤，影响分析的稳健性、准确性和灵敏度，分析步骤主要包括细胞裂解、蛋白质提取、分离、酶消化和脱盐[57]。蛋白质组学技术在食品领域应用面临的一大问题是蛋白质回收率普遍偏低，如何有效提高提取效率是提高该类方法回收率的关键。在提取食品中蛋白质时，大多通过使用裂解缓冲液提高提取效率。裂解缓冲液含有尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇双（2- 氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）等试剂。一般情况下，提取液成分复杂，需要对样品中所含蛋白质进行富集和净化。食品中蛋白质富集净化常用方法包括使用有机溶剂、等电点沉淀蛋白和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 分离富集蛋白，根据检测目的的不同选择合适的方法。化妆品中的蛋白质提取、富集方法与食品基本一致。需要注意的是，食品中蛋白质组成复杂，高丰度蛋白质或肽段可能会干扰低丰度蛋白质或肽段的检测，需要有效的预分离程序降低样品的复杂性。此外，通过鸟枪法这种蛋白质组学方法可将1 个蛋白质分子转化为多个肽段，从而导致样品复杂度增加[58]。在血液样本中，利用高丰度蛋白质去除试剂盒可以去除样本中的高丰度干扰蛋白质，提高检测痕量生物标志物的灵敏度[59]。目前，食品领域还未涉及高丰度蛋白质去除试剂盒，主要利用凝胶电泳和液相色谱对蛋白质或肽段进行分离[60]。同时，除提高提取效率外，还可从质谱端入手，提高蛋白质鉴定效率，如所有理论碎片离子质谱的顺序窗口采集技术（SWATH-MS）使用相当大的母离子分离窗口以系统且无偏的方式将给定样品的所有离子化肽段落入指定质量范围内， 对所检测的离子进行全面的定性定量分析[61]。
4.2 使用方法过程中的问题与建议
近年来，随着质谱仪器性能的提升，质谱法已被广泛应用于大分子蛋白质和多肽的绝对定量研究领域。其中，利用靶向蛋白质组学技术， 如多重反应监测（MRM）、平行反应监测（PRM）技术结合标准品可以对目标蛋白质或者多肽进行多重精确定量。利用基于质谱的蛋白质组学技术对蛋白质含量进行绝对定量分析时，需要使用标准化参考样品，这是因为此类研究间样品比较在确定蛋白质含量时所提供的信息只是相对的。目前，蛋白质组学技术绝对定量分析仅在有限数量的已知靶蛋白和肽上进行，该技术主要受限于对合成和适当表征的肽和蛋白质标准品的需求。一方面，对于加标回收率的评价大多只涉及酶解前加入标准肽段，回收率普遍较高，但只是评价了酶解过程的回收率，无法反映整个样品前处理方法的真实回收率，实际应加入目标蛋白来评定真实回收率。另一方面，肽段标准品定值方法多样，常用方法有质量平衡法、氨基酸分析法、化学衍生化法和元素分析法等，但这些方法普遍耗时长、成本高。有研究者开发了基于定量标签特异性吸收紫外线（UV）波长用于标记肽的基于UV 的定量新方法，该方法成本低、准确度高，且能够用于直接定量重组的UV 标记肽，直接控制和监测与肽溶解度、沉淀以及吸附等有关的问题[62]。还有研究者使用高效液相色谱法（HPLC）检测内在酪氨酸荧光的替代方法，表征了对应合成的21残基合成肽的荧光特性，并建立了一种涉及相对于非肽校准物N-乙酰-L- 酪氨酸乙酯的定量方法[63]。目前，多肽标准物质只有HPLC 级别，纯度仅大于95%，不能准确反映样品中肽段含量，建议相关部门尽快出品肽段标准物质，或者由方法使用者自行标定标准肽段。
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来源：中国食品药品监管杂志
关键词：
蛋白质组学
