（一）Trizol法

 

一、 实验原理

 

Trizol是一种酸性试剂，能从细胞和组织中快速分离RNA，其主要成分为异硫氰酸胍（GITC）和苯酚。裂解细胞后，GITC能使蛋白质和RNase变性，有利于保护RNA的完整性；加入氯仿离心后，样品分为水相和有机相，RNA存在于上层水相中，而DNA和蛋白质则存在于中间层及下层有机相中，从而达到分离的目的。简单来讲就是裂解细胞使RNA得以释放，加之有机溶剂使RNA与DNA、蛋白质分离，并进一步纯化得到RNA的过程。

 

二、 主要的试剂、仪器与耗材

 

Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase free Water、低温冷冻离心机、匀浆器或组织研磨器、涡旋振荡器、金属浴、微量移液器、通风橱、计时器、1.5ml EP管等。

 

三、 提取步骤

 

1.样品的制备

 

1)细胞：按1ml Trizol试剂/5-10×10^6细胞的比例加入Trizol试剂（注：一般来讲待细胞在六孔板上生长至80%左右时，每孔收集的细胞加1ml Trizol即可）；

 

2)组织：按1ml Trizol试剂/50-100mg组织的比例加入Trizol试剂并在冰上匀浆处理，以利于RNA的释放（注：组织可以先用液氮急冻后研磨处理，也可用匀浆器或者组织研磨器进行处理，但要注意保持低温，以防RNA降解）；

 

室温裂解5-10min。

 

2.氯仿抽提

 

每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，盖好EP管盖后用手剧烈颠倒混匀15s左右，室温孵育2-3min。2-8℃，12000g离心15min后溶液分为三层，从上到下依次为水相（RNA）、中间层及有机相（DNA、蛋白质等），转移水相至新的EP管中（注：此步一定要小心谨慎，慢慢吸取，不可触及中间层，以免RNA被污染）。

 

3.异丙醇沉淀

 

每1ml Trizol中加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀后，室温孵育10min，2-8℃，12000g离心10min，得到的白色沉淀即为RNA沉淀（注：异丙醇最好提前预冷，维持低温环境，以防RNA被降解）。

 

4.乙醇洗涤

 

弃去上清，加入1ml 75%乙醇（每1ml Trizol）洗涤RNA沉淀，2-8℃，7500g离心5min（注：75%乙醇可以用无水乙醇及无酶水来配制，同样最好预冷处理；清洗时动作要轻柔，过于剧烈会导致RNA沉淀散开，再次离心未免会重聚，从而造成RNA的损失）。

 

5.溶解

 

弃去上清，于通风橱内干燥RNA沉淀5-10min，用50ul左右的无酶水重悬沉淀，即可得到RNA溶液（注：干燥时间不可过长，太过干燥会导致沉淀很难溶解，部分溶解的RNA的260/280的比值会大大降低，甚至低于1.6；亦可采用金属浴60℃，5min以助溶）。

 

6.RNA质量的检测

 

1)微量分光光度计

 

纯RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小，则代表可能有蛋白或有机溶剂的污染，比值偏大则代表RNA可能发生降解。

 

2)琼脂糖凝胶电泳

 

可见三条带，从上往下一般为28s RNA、18s RNA及5s RNA，一般情况下5s的带非常淡，甚至看不清，28s带的亮度应为18s带亮度的2倍，且不存在拖尾，即可证明RNA纯度可以，如若5s很明显，而28s 与18s带的亮度并无太大差别，甚至出现涂抹状的条带则高度提示RNA降解。

 

（二）柱式法

 

一、 实验原理

 

离心柱法主要是利用离心柱中的硅胶基质吸附RNA，再通过洗涤去除杂质从而得到RNA的一种常用方法。相较于Trizol法，离心柱法因操作简便、耗时短、纯度高等优点而得到广泛应用，但也因其吸附柱规格的限制在大批量操作时具有一定的局限性，此外，针对特殊的样本，其提取的效果也大不如Trizol法好。

 

二、 主要的试剂、仪器与耗材

RNA提取试剂盒、氯仿、无水乙醇、RNase free Water、低温冷冻离心机、匀浆器或组织研磨器、微量移液器、通风橱、计时器、1.5ml EP管、2ml EP管等。

 

三、 提取步骤

1.样品处理：

细胞：贴壁细胞每106细胞加入1ml裂解液，吹打混匀。

 

悬浮细胞：植物、动物、酵母每10^6细胞加入1ml裂解液。

 

细菌细胞每107细胞加入1ml裂解液混匀。

 

组织：新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，匀浆处理。

 

2.室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；

 

3.向匀浆样品中加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3-5min；

 

4.2-8℃，12000rpm离心10min。RNA主要存在于上层水相中把水相转移至新的EP管中（注：不可吸到沉淀）；

 

5.吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2min，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液（小Tips：此步可以在第四步离心还剩2min左右的时候进行，这样第四步离心结束就可以直接进行洗柱，而不需要再等时间）；

 

6.在收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱中静置2min，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

 

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液（注：新买的试剂盒中漂洗液还需要加入一定量的无水乙醇，此步一定要确认漂洗液是否加入无水乙醇），2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

 

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液（注：漂洗液在7-8步共加了两次哦）；

 

9.12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温数分钟（10-15min）以去除残留的漂洗液（注：最好在通风橱进行，以免RNA酶对RNA的降解；通风橱在使用前也可先紫外30min）；

 

10.将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O（通常取中间值），室温放置5min，12000rpm室温离心2min即可得到RNA溶液（注：所有步骤中仅最后一步离心是在室温，其余均在2-8℃，因此，前几步离心拿出样品后一定要及时关上离心机盖子，以免升温，而在第9步离心结束后就可以打开离心机盖子使其快速升至室温）。

 

四、 注意事项

1．佩戴手套、口罩，消毒操作台，杜绝外源酶的污染；

2．所用试剂耗材必须无酶化，有条件者可以直接购买，否则就要做好高压灭菌的工作；

3．得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反复冻融，放置时间不可过长；

4．对于组织RNA的提取，一定要充分匀浆处理以使RNA充分释放出来。

 

来源：实验老司机

关键词： RNA提取