一、实验原理

 

通常地，在未受到刺激的细胞中，NF-κB通常与抑制蛋白IκB结合形成复合物，存在于细胞质中。然而，当细胞受到细胞因子（如IL-1β、TNF等）、脂多糖（LPS）等外界刺激时，在经典的NF-κB信号通路中这些刺激信号首先与细胞膜上的相应受体结合最后导致IκB被降解，进而释放出NF-κB二聚体，自由的NF-κB二聚体由于其C端结构域上的核定位区域暴露，能够通过核孔复合物进入细胞核。在细胞核内，NF-κB二聚体与有NF-κB结合位点的基因启动子区域或增强子区域特异性结合，启动相关基因的转录。

 

 

NF-κB是细胞内重要的转录因子，其活性受到严格调控。通过检测NF-κB移位入核情况，可深入了解细胞在受到各种刺激（如细胞因子、病原体感染、物理化学因素等）后，NF-κB信号通路的激活机制，包括信号的起始、传导、放大以及与其他信号通路之间的交互作用。另外，检测其移位入核有助于确定在不同生理或病理条件下，NF-κB所调控的具体基因靶点，以及这些基因在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应等过程中的作用。 

 

二、实验步骤

 

（1）细胞培养与刺激

 

准备适合大小的无菌爬片放在12孔板中，可用PBS润洗孔板使得玻璃爬片更加贴合孔板底部；状态良好的细胞铺于12孔板中，37°C、5%CO₂培养48h。将细胞培养至80%左右的浓度后，加入适当的刺激剂，如TNF-α或IL-1β，在特定的时间点进行刺激，同时设置未刺激的阴性对照组。

 

（2）处理孔板与固定细胞

 

处理好的孔板，PBS轻轻润洗细胞2-3次，使用4%多聚甲醛在室温下固定30min；固定完成后，用PBS洗涤细胞3次，每次约5min，去除固定剂。

 

（3）细胞通透处理

 

PBS稀释10% TritonX-100至0.2%加入固定的细胞中，室温下通透孵育15min，使抗体能够进入细胞内部与抗原结合。随后，用PBS润洗3次，每次5min。

 

（4）封闭非特异性结合位点

 

使用5%牛血清白蛋白（BSA）室温下孵育1h。孵育完成后，用PBS洗涤细胞3次，每次10min。

 

（5）细胞免疫染色

 

用PBS配置5%牛血清白蛋白的稀释液，稀释抗-NF-κB抗体并孵育细胞， 4°C下孵育过夜。一抗孵育完成后，用PBS洗涤细胞3次，每次10min。

 

（6）二抗染色

 

用PBS配置5%BSA的稀释液，按照相应比例稀释荧光标记的二级抗体孵育细胞，室温下孵育1h。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次10min。

 

（7）细胞核染色

 

使用荧光染料，如DAPI或Hochecst，将细胞核染色，通常在室温下孵育15min。然后用PBS洗涤细胞3次，每次约10min。

 

（8）封片与观察

 

准备好镊子并配置90%的甘油（丙三醇）进行封片。通常地，一块载玻片放置2块爬片，首先在载玻片上滴加20ul90%甘油，用吸水纸吸干爬片上的液体，将细胞爬片倒扣在甘油滴或更换适量的抗荧光淬灭封片液进行封片，并用高亮透明的指甲油在爬片周围固定爬片。最后用激光共聚焦显微镜观察细胞免疫荧光。

 

（9）蔡司激光共聚焦显微镜（LSM900）的简单操作步骤

 

1、开机流程：根据标签1-8的顺序开机包括激光、显微镜、主机等。双击打开蓝色ZEN System，等待系统自检和初始化。

 

标签[1]：激光器，控制激光；钥匙控制开启时由【0】拧到【1】，例如图1

 

标签[2、3]：总控制器

 

标签[4]：载物台控制器

 

标签[5、6]:显微镜控制器

 

标签[7]:荧光光源开关

 

标签[8]：电脑主机

图1 标签【1、2、3】

 

图2 显微镜的大致组成（激光、显微镜、主机）

 

2、拍摄2D图像

 

1）在软件界面中找到Locate按钮，点击其中的BF，GFP等快捷键(快捷按钮选择样品染料颜色)，切换至人眼观察模式。在TFT触摸屏上，找到所选用物镜，调好焦距。找到焦平面。

 

2）切换至Acquisition，点击Smart Setup，选择所用荧光染料。选择模式，自动匹配光路设置。

 

3）在Channels菜单栏中调节激光强度与Master Gain值。在live预览模式下使用Range Indicator判定图像质量。

 

4）当图像出现蓝色背景与即将出现红色过曝光点时stop并设置Acquisition Mode.选择合适的像素分辨率扫描速度等。

 

5）点击Snap按钮，拍摄并注意保存。

 

3、拍摄Airyscan 超高分辨率图像

 

1）点击Smart Setup，选择需要的染料；点击Airyscan。

 

2）在Channels菜单栏中调节激光强度与MasterGain值，注意不要过曝:

 

3）在Acquisition Mode选择最快的扫描速度，不做平均，Zoom不小于1.3x,设置好后点击Snap拍摄。

 

4）拍摄后进入Processing-Airyscan Processing.5.2D SR Processing-Input-Apply进行图像处理

 

4、图像导出

 

可根据需要选择Processing>lmage Export/MovieExport，对采集的图像进行导出。

 

5、关机流程

 

（1）将样品移出，保存数据并关闭软件。关闭电脑。

 

（2）清洁显微物镜，并将其转到空位或低倍镜上

 

（3）依照标签7-1顺序，逆序关闭系统。

 

6、图片分析处理

 

（1）优势：高分辨率，多通道荧光，图片拼接以及组织切片层数扫描。

 

（2）图3是由油镜 63×拍摄的NF-κB移位入核：

 

图3 NF-κB移位入核

 

（3）添加比例尺：点击图片下方【Graphics】，点击红色区域，自动添加比例尺。

 

图4 添加比例尺

 

三、注意事项

 

1、选择处于对数生长期、状态良好的细胞进行实验，细胞密度最好在70%~80%左右，密度过大或过小都可能影响实验结果。

 

2、注意要根据一抗的种属来源选择相应的二抗，且从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。

 

3、选择与目标蛋白高度特异性结合的抗体，并确保一抗和二抗的种属匹配，避免交叉反应。同时，要根据实验需求选择合适荧光标记的抗体。

 

4、在固定与通透的过程中，固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛。通透剂的浓度和时间也要根据细胞类型和抗原位置进行优化，避免过度通透导致细胞结构破坏。

 

5、封闭液的种类和浓度要选择合适，封闭时间要足够，以减少非特异性抗体结合

 

6、一抗和二抗的孵育时间和温度要根据抗体说明书进行优化，孵育过程中要注意保持样品的湿润，避免干燥。同时，要注意控制抗体的浓度，避免过高或过低导致假阳性或假阴性结果。

 

7、根据实验要求选择合适的荧光染料，考虑其激发和发射波长，以确保荧光信号可以被检测设备有效捕捉。同时，要注意荧光染料的稳定性和淬灭问题，从加荧光二抗起，尽量避光操作，封片后应尽早拍摄。

 

8、设置阳性对照组和阴性对照组，以确保实验结果的准确性和可靠性。阳性对照组可以使用已知能诱导NF-κB入核的刺激剂处理细胞，阴性对照组则不添加任何刺激剂。

 

9、正确使用激光共聚焦显微镜，观察时要注意区分细胞的自发荧光和特异性荧光信号，避免误判。 

 

 

来源：实验老司机

关键词： 细胞免疫荧光