1. 实验概述

 

在分子生物学实验中，细菌克隆形成单位（CFU）主要用于检测三方面：

 

一是检测细菌数量，以菌落数代表活菌数，用于评估食品等受细菌污染程度；

 

二是反映细菌活力，处理前后CFU数量变化可体现处理对细菌活力的影响；

 

三是探究细菌生长特性，借不同培养条件下CFU情况了解细菌对环境的适应性。

 

例如：CFU可反映免疫细胞例如巨噬细胞防御细菌的作用功能，体现细菌的存活率。在医学研究应用广泛。

 

疾病诊断上，能检测痰液等样本中的病原菌及数量，还可筛查耐药菌，例如结核分枝杆菌。下面介绍了细菌克隆形成单位（CFU）的基本实验步骤和注意事项。 

 

2. 实验步骤

 

2.1 准备工作

 

（1）实验器材和试剂：准备无菌的培养皿、移液器、吸头、LB培养基（或其他适合细菌生长的培养基例如分枝杆菌培养的Middle Brook 7H10固体培养基）、恒温培养箱（37℃）、0.1% TritonX-100裂解液、无菌PBS、抗生素（氨苄青霉素、两性霉素B、羧苄青霉素）。

 

（2）将培养基高温高压灭菌，待冷却至约50~60℃左右时（手可以直接接触的温度），在超净工作台中倒入培养皿，每个培养皿倒入约15~20 mL培养基，使其均匀铺满培养皿底部，待培养基凝固后备用。

 

2.2 以巨噬细胞吞噬分枝杆菌为例，具体实验步骤如下：

 

（1）接种细胞：将1×106个/孔的巨噬细胞的铺至6孔板，5%CO2，37℃的培养箱培养24~48 h。

 

（2）实验干预：根据自己实验要求用不同的药物浓度干预细胞，然后以细胞数目的10倍的菌浓度（MOI=10）感染细胞。

 

感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）：是指在感染时病毒或噬菌体与细胞或细菌数量的比值。例如MOI=10，即以细胞数目10倍的菌浓度感染目的细胞。

 

（3）细菌CFU测定：

 

感染处理：感染后4 h后用1×PBS洗涤细胞3次，并加入5%的青霉素-链霉素混合溶液杀死胞外菌；重新孵育6 h后更换不含青霉素-链霉素的培养基。细胞继续孵育24 h后，用1×PBS洗涤细胞，用0.1% TritonX-100充分裂解细胞15 min，加入完全培养基或者PBS终止裂解；并将细胞收集至2 mL的离心管，200 rpm 振荡10 min。

 

2000 rpm 3 min收集细胞沉淀，并用1 mL完全培养基重悬细胞，将收集的细胞裂解液连续稀释成不同浓度菌悬液。

 

为使取液方便，稀释前将菌母液移装至5 mL EP管，取新的EP管9只，分别编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，每只装900 μL无菌PBS。用移液枪吸取菌母液100 μL菌液至EP管1制成1mL菌悬液，旋涡振荡器混匀即为第一稀释梯度菌悬液(10-1)；吸取100 μL试管1(10-1)梯度菌悬液至编号2的试管中，混合均匀，得到第二稀释度的菌悬液(10-2)，以此类推，得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度菌悬液。

 

将上述步骤稀释好的菌悬液取一定量（通常50~100 μL）依次涂布在目标培养基中，分枝杆菌需要放置37℃的培养箱培养3~4周左右。

 

定期观察细菌生长状态以及生长密度，选择生长密度适中的菌悬液进行2次涂布。

 

CFU手动计数：在菌悬液生长密度正常的情况下，能够清晰看到规定时间内菌生长的数目，因此可以通过肉眼直观的进行菌的克隆单位计数；但密度过小或者过大均可能导致一定误差（图1）。人工手动计数，CFU以3份为单位计数。若细菌克隆数目越少，说明实验干预能够促进对细菌的杀伤；相反实验干预促进细菌的存活。

 

计算：原菌液浓度(CFU/mL)=实际菌落数(CFU)/取样体积(mL)*稀释倍数。

 

3. 注意事项

 

（1）菌实验操作过程均在超净工作台或者生物安全柜中进行，严格遵守无菌操作原则，防止杂菌污染。

 

（2）稀释菌悬液时，要确保移液器的准确性，避免吸取液体体积不准确导致稀释倍数错误。同时，每次稀释后要充分混匀，使细菌均匀分布在稀释液中。

 

（3）涂布前，应充分用酒精灯灼烧涂布棒，冷却后将移液枪转移的菌液涂抹均匀，以免高温杀死细菌。

 

（4）涂布时充分涂匀菌悬液，注意力度均匀，避免划破培养基表面，同时要确保菌液均匀涂布在整个平板上，避免出现局部菌液过多或过少的情况，涂布过程中可以不停地转动培养基。

 

（5）估算菌落时，可以借助放大镜或菌落计数器进行计数。同时，要对每个稀释度的平板进行多次计数，取平均值提高计数的准确性。

 

（6）注意防护，注意穿实验服、戴口罩和戴手套。

来源：实验老司机

关键词： 细菌克隆