背景
在过去的半个多世纪里,小分子细胞毒素药物广泛用于治疗各种恶性肿瘤,在某些临床条件下,改变了其中一些疾病的自然进程。但由于它们内在的作用方式,容易引起严重的靶外不良事件从而妨碍其临床疗效,进而导致早期停药、肿瘤复发或复发的风险也随之增加。例如普纳替尼(ponatinib),在一项名为PACE的研究中,28个月的随访期显示,普纳替尼增加了心脏毒性的风险,包括10%的心血管、7%的脑血管和7%的周围不良事件[1]。
为了提高对癌症患者的疗效,科学家们研发出一种可以选择性靶向肿瘤细胞的细胞毒素药物,以期提高化疗药物的有效性并降至最低全身毒性。在这些新颖的药物中,结合了细胞毒性药物的人源化抗体,即抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate, ADC), 跻身于癌症科学与临床发展的行列[2]。2000年,FDA首次批准了用于治疗成人CD33阳性急性髓性白血病的ADC药物:Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicin)[3],标志着癌症靶向治疗药物ADC时代的开始。2021年6月,首个国产ADC药物,荣昌生物研发的维迪西妥单抗获批上市。ADC药物技术一直在迅速发展,截止目前,全球共有15款ADC药物获批上市,有200多款ADC药物正在进行临床试验。大多数ADC药物已从I期进展到II期,部分ADC药物的III期试验显示出积极的结果。这个新兴的化疗分子药物被视为最有效的抗癌治疗剂之一,预计在不久的将来会显著增加它的市场份额[4]。
什么是ADC
ADC是指通过连接子将小分子化合物偶联至靶向性抗体或抗体片段的一类生物技术药物,其结构组成包括抗体或抗体片段(Antibody),连接子(Linker),具有细胞毒性的小分子化合物(Payload)(图1)。其中,抗体通常选用可被靶细胞内化的抗体;连接子具有一定的循环稳定性,可以支持药物在到达靶器官前不被降解或者少量降解,进入细胞后能够快速释放活性小分子化合物;小分子化合物能够对靶细胞产生药效作用。因此,ADC是生物大分子和化学小分子的结合体,具有独特的作用机制和代谢动力学特征[4]。
图1:ADC结构,图片引自[4]
ADC的作用机制及其优势
ADC药物中的单克隆抗体表现出选择性附着和进入抗原过度表达的癌细胞的能力。ADC药物随后通过一系列细胞内化过程被带入肿瘤细胞内,这一过程从早期含体形成开始,发展到晚期内含体的成熟,并最终与溶酶体融合。ADC的有效载荷在溶酶体内通过化学或酶作用发生裂解,释放后,这种有效载荷通过破坏目标细胞内的DNA或微管发挥其细胞毒性,最终导致癌细胞的死亡(图2)。此外,如果释放的有效载荷具有透过细胞膜的能力,它还能引发“旁观者效应”,即不需要ADC的内化作用就能引起邻近的靶细胞发生凋亡。因此,由于ADC药物精准的抗体结合和有效载荷的促凋亡能力,它在癌症治疗方面具有多种优势,包括治疗窗口及疗效增强,耐药性降低,癌细胞特异性靶向,对正常细胞的毒性相对较低,与传统化学癌症治疗相比,副作用较小等[5]。
图2:ADC的作用机制,图片引自[5]
ADC的PK生物分析策略
ADC进入体内后,payload可通过酶解或者化学反应从主体结构上逐渐解离,主要包括偶联抗体、抗体偶联药物、总抗体、裸抗、游离的小分子payload以及payload相关的代谢产物等。他们在体内的浓度变化对解读ADC的PK药代动力学特点至关重要。ADC为抗体或抗体片段至少结合一个payload(抗体偶联比(Drug to antibody ratio,DAR)≥1);总抗体为未偶联和偶联至少一个payload分子的抗体的总和(DAR≥0);Payload为ADC裂解或被分解代谢后形成的游离的payload,在FDA于2022年2月发布的“Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates”指导原则草案中指出,在对ADC药物进行生物分析时,应该测定多种生物分析物用于评估ADC暴露量,例如:体内的总抗体含量、ADC含量以及小分子payload部分和药理活性代谢产物的含量[6][7]。目前已经上市的ADC药物的PK检测主要包括总抗体、ADC和小分子化合物部分。一般总抗体和ADC的检测主要在LBA平台开展,小分子化合物部分在LC-MS平台进行。本篇主要对在LBA平台开展ADC的PK检测展开讨论。
对于总抗体和ADC部分的检测,通常采用ELISA或MSD平台。针对总抗体,通常利用靶点或抗裸抗的特异性抗体作为捕获试剂进行包被,再选择酶标的抗裸抗特异性抗体或普抗作为检测抗体进行检测(图3A)。针对ADC,通常利用抗payload特异性抗体作为捕获抗体进行包被,再选择酶标的抗裸抗特异性抗体、普抗或者靶点作为检测抗体进行检测(图3B)。以已上市的ADC药物Enhertu为例,它的主体是抗Her2抗体,有效载荷为Dxd,该上市药物的PK检测中,总抗体和ADC的检测是在ECL平台进行的,总抗体的检测中分别使用anti-HER2 antibody的特异性单克隆抗体作为捕获试剂和检测试剂,而ADC的检测中使用抗小分子抗体anti-Dxd antibody作为捕获抗体,检测抗体则使用测的是anti-HER2 antibody的单克隆抗体。
图3:总抗体和ADC的PK生物分析,图片引自[8]
ADC的PK生物分析挑战
由于ADC自身所具有的特殊结构和复杂的组分多样性,其PK生物分析方法的建立具有很大的挑战性,本篇主要针对在LBA开展的ADC的PK检测展开讨论,在LBA平台进行ADC的检测时主要有以下几个挑战:(1)DAR值敏感性,当ADC进入体内后,payload可通过酶解或者化学反应从主体结构上逐渐解离,产生不同DAR值的ADC药物,而ADC标准品往往不能准确的反应体内ADC药物的真实情况,尤其是PK靠后的一些采样时间点样本[9],另外不同DAR值的ADC药物与捕获试剂或者检测抗体的结合能力可能不同,影响总抗体和ADC浓度的准确度测定,尤其体现在一些高DAR值的ADC和低DAR值的ADC药物间。(2)小分子毒素结构的改变,目前在研的小分子毒素主要有DNA损伤剂、DNA转录抑制剂、微管蛋白抑制剂、美登素、喜树碱类、Tubulysin B类似物等,其化学结构可能会随着药物在体内的生物转化和分解代谢而发生改变,从而也带来它独特的生物分析挑战。例如,像喜树碱类的衍生物,作为DNA拓扑异构酶I的抑制剂,分子中的内酯环,是主要的活性基团,但结构不稳定,在pH上升时会打开,打开后的结构会改变和抗体之间的结合能力,从而影响PK的检测[10];另外有些小分子毒素在体内会发生转化,PK的检测形式也会增多,例如ADC药物MEDI4276,临床的PK检测包含了总抗体,小分子毒素转化前后的ADC,游离的转化前后的小分子毒素5种形式[11]。(3)可溶性靶点蛋白,当循环系统中有高浓度游离的可溶性靶点蛋白时,可能会影响抗原或者是特异性抗体和药物的结合效率,从而对PK的检测带来一定的影响。(4)抗药抗体,当体内有抗药抗体或者是中和抗体产生时,都会对PK的检测带来影响,抗药抗体可能会带来空间位阻的影响,而中和抗体会直接影响抗原或者特异性抗体和药物的结合。
DAR敏感性考量
药物抗体偶联比(drug-to-antibody ratio, DAR)是指一个抗体所携带payload数量的平均值,是ADC最重要的质量属性之一,因为这决定了可以输送到肿瘤的“有效载荷”,可以直接影响安全性和有效性。较低的DAR会降低ADC的效力,但过高的DAR又会影响ADC分析的药代动力学和毒性。ADC药物的DAR值通常为0到8之间,普遍认为DAR在3-4之间是ADC药物的最优选择[12]。
ADC进入体内后,连接子可能由于酶解或其他的作用发生断裂,使得payload从主体结构上逐渐解离,产生不同形式的ADC。以DAR8的ADC为例,在进入人体内后可产生DAR6、DAR4、DAR2等形式的ADC。不同DAR的ADC分子可能会有不同的清除率[12],所以随着给药时间的推移,不同访视点采集的样本中ADC的DAR值分布可能会有很大的不同,尤其是在给药周期比较靠后的时间点。因此在建立PK生物分析方法的时候,需要考虑检测方法对不同DAR形式的ADC的敏感性,即无论ADC在体内以何种DAR的形式存在,都能准确的被检测到。
首先对于ADC的检测,可以使用靶点蛋白作为捕获试剂,抗小分子毒素的抗体作为检测试剂,也可以使用抗小分子毒素的抗体作为捕获试剂,使用靶点蛋白作为检测试剂,往往后者在DAR敏感性测试中有比较好的结果,图4是在一款ADC的PK检测中使用2种不同assay format在DAR敏感性中的差异。从图中可以看出,当使用靶点蛋白作为捕获试剂,抗小分子毒素的抗体作为检测试剂时,随着DAR值的降低,QC的回收率也随之降低;当使用抗小分子毒素的抗体作为捕获试剂时,不同DAR值的ADC间的QC差异较小,整体的回收率都在80%-120%之间。这和文献中的报道也比较一致,在ADC的检测中建议使用抗小分子药物的抗体作为包被试剂,不同ADC间检测的结果更加一致。
图4:ADC检测中不同assay format下不同DAR值ADC样品的回收率
在另一款ADC的检测中,使用抗小分子毒素的抗体作为捕获试剂,使用抗ADC抗体部分的单克隆抗体作为检测试剂,不同的包被抗体浓度下,不同DAR值的ADC样本间检测差异也显著不同,见图5,当包被浓度为1.0 ug/ml时,DAR=2时的ADC样本在高浓度,中浓度和低浓度质控样本间的回收率都偏低,低于方法中80%-120%的接收标准,随着包被浓度的提高,低DAR值的ADC样本间的回收率逐渐提高,当包被浓度提高到2.5 ug/ml时,不同DAR值的ADC样本间检测的结果较一致。
图5: ADC检测中不同包被浓度下不同DAR值样本的回收率
另外在总抗体的检测中,可以使用靶点蛋白作为捕获试剂,通用性抗体作为检测试剂,但这种assay format情况下,可能会出现裸抗的检测结果远高于总抗体的情况,如图6中的案列,当使用靶点蛋白作为捕获试剂时,裸抗样本的回收率整体远高于总抗体,并且回收率大多超出方法规定的接收标准(图6左),当将靶点蛋白调整为特异性更好的抗体时,总抗体和裸抗的检测结果比较一致(图6右)。
图6: 总抗体检测中不同包被试剂在总抗体和裸抗之间的差异
结语
ADC药物由于自身的特殊结构和复杂的组分多样性,给PK的生物分析方法建立带来很大的挑战,开发一款准确而稳定的ADC生物分析方法对药代动力学的研究至关重要,一般总抗体和ADC的检测在LBA平台展开,小分子化合物的检测在LC-MS平台开展。在LBA平台开发ADC的PK检测一般需要考虑DAR值敏感性、靶点干扰、小分子毒素带来的影响之外,也需要关注总抗体和ADC检测浓度之间的关系。
参考文献
[1] Pun, Shawn C., and Tomas G. Neilan. "Cardiovascular side effects of small molecule therapies for cancer." European Heart Journal 37.36 (2016): 2742-2745.
[2] Hervé Bouchard, Christian Viskov, Carlos Garcia-Echeverria: Antibody–drug conjugates—A new wave of cancer drugs. [J]Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 24 (2014) 5357–5363
[3] Zhiwen Fu, Shijun Li, Sifei Han, Chen Shi1 and Yu Zhang, Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy, [J]Signal Transduction and Targeted Therapy (2022) 7:93
[4] Kyoji Tsuchikama , Zhiqiang An, Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries, [J] Protein Cell 2018, 9(1):33–46
[5] Chi Hun Song, Minchan Jeong, Hyukmin In, Ji Hoe Kim, Chih-Wei Lin and Kyung Ho Han, Trends in the Development of Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy, [J]Antibodies 2023, 12, 72.
[6] Gorovits B, Alley SC, Bilic S, Booth B, Kaur S, Oldfield P, Purushothama S, Rao C, Shord S, Siguenza P. Bioanalysis of antibody-drug conjugates: American Association of Pharmaceutical Scientists Antibody-Drug Conjugate Working Group position paper. Bioanalysis. 5(9):997-1006(2013).
[7] Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates, Retrieved February 11, 2022.
[8] Qiuping Qin and Likun GongCurrent, Analytical Strategies for Antibody–Drug Conjugates in Biomatrices, [J] Molecules 2022, 27, 6299.
[9] Surinder Kaur, Keyang Xu, Ola M Saad, Randall C Dere & Montserrat Carrasco-Triguero, Bioanalytical assay strategies for the development of antibody–drug conjugate biotherapeutics, Bioanalysis (2013) 5(2), 201–226
[10] Uland Y. Lau, Lauren T. Benoit, Nicole S. Stevens, Kim K. Emmerton, Margo Zaval, Julia H. Cochran,and Peter D. Senter, Lactone Stabilization is Not a Necessary Feature for Antibody Conjugates of Camptothecins, [J]Mol. Pharmaceutics 2018, 15, 4063−4072
[11] Faria, M.; Peay, M.; Lam, B.; Ma, E.; Yuan, M.; Waldron, M.; Mylott Jr, W.R.; Liang, M.; Rosenbaum, A.I. Multiplex LC-MS/MS Assays for Clinical Bioanalysis of MEDI4276, an Antibody-Drug Conjugate of Tubulysin Analogue Attached via Cleavable Linker to a Biparatopic Humanized Antibody against HER-2. Antibodies 2019, 8, 11.
[12] Xiuxia Sun, Jose F. Ponte, Nicholas C. Yoder, Rassol Laleau, Jennifer Coccia, Leanne Lanieri, Qifeng Qiu, Rui Wu, Erica Hong, Megan Bogalhas, Lintao Wang, Ling Dong, Yulius Setiady, Erin K. Maloney, Olga Ab, Xiaoyan Zhang, Jan Pinkas, Thomas A. Keating, Ravi Chari, Hans K. Erickson,§ and John M. Lambert, Effects of Drug−Antibody Ratio on Pharmacokinetics, Biodistribution, Efficacy, and Tolerability of Antibody−Maytansinoid Conjugates, Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1371−1381
来源:药明康德测试事业部
关键词:
抗体偶联药物