一、PCR实验概述

 

PCR，即多聚酶链式反应，是一种简单便捷且高效的DNA扩增技术。在PCR实验中，往往会出现一些异常问题，以下对常见的一些问题进行了分析，并给出了解决方案，希望对大家有所帮助。

 

二、常见问题及解决方案

 

1、假阳性

 

原因：可能是引物特异性不好/靶序列太短或引物太短或者靶序列或扩增产物出现交叉污染。

 

方案：

 

（1）引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验；

 

（2）除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒；

 

（3）操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

 

（4）各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

 

2、假阴性，不出现扩增条带

 

 

原因：引物设计有问题或者引物浓度不对或引物发生降解；模板含有抑制物，含量；Buffer对样品不合适；反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。

 

方案：

 

（1）引物引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致；

 

（2）纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量；

 

（3）更换Buffer或调整浓度；

 

（4）重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物；

 

（5）降低退火温度、延长延伸时间。

 

3、非特异性扩增带 

 

 

原因：引物与靶序列不完全互补，引物有二聚体；退火温度过低，PCR循环次数过多；模板或引物浓度过高；Mg2+浓度偏高。

 

方案：

 

（1）降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；

 

（2）降低镁离子浓度；

 

（3）适当提高退火温度或使用二阶段温度法；

 

（4）减少循环次数。

 

4、拖尾—产物在凝胶上呈Smear状态

 

 

 

原因：模板不纯；Buffer不合适；退火温度偏低；dNTP、Mg 2+浓度偏高；循环次数过多。

 

方案：

 

（1）纯化模板；

 

（2）更换Buffer；

 

（3）适当提高退火温度；

 

（4）适当降低dNTP和镁离子的浓度；

 

（5）减少循环次数。

 

5、带大小与预期理论值不一致

 

原因：污染问题；模板或引物使用不当；基因的不同亚型。

 

方案：

 

（1）实验中的污染可能会干扰PCR产物的大小。为了避免这种情况，应使用全新的试剂和枪头，并彻底清洁实验工作台，确保实验环境的洁净；

 

（2）重新选择并使用正确的引物和模板DNA；

 

（3）遗传多样性可能导致目标基因存在不同的亚型，这些亚型在序列上的差异可能会影响PCR产物的大小。对目标基因进行详细的序列分析和使用BLAST等生物信息学工具进行相似性搜索，可以帮助识别并考虑这些基因亚型的影响。

 

来源：实验老司机

关键词： PCR实验