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翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs）由于通常是通过在蛋白分子上增加一个基团达成修饰，对分子本身有物理改变，很可能对WB实验结果有所影响。由于翻译后修饰形式多种多样，对条带影响的具体表现包括但不限于以下所举例子：

 

1.  分子量变化：磷酸化、糖基化、泛素化、泛素化等众多翻译后修饰形式会改变目标蛋白的分子量，可能导致靶标蛋白实际检测分子量大小出现偏差，蛋白样品在凝胶上的迁移位置与未修饰蛋白相比发生偏移，出现更高或更低的分子量带。

 

2.  构象变化：由于其空间结构发生一定改变，将可能影响抗体与表位的结合，从而减少信号或引起非特异性结合。

 

3.  电荷变化：如乙酰化、磷酸化等修饰可以改变蛋白的整体电荷，可能影响电泳过程中的蛋白迁移速率等方面。

 

4.  溶解性和稳定性：翻译后修饰可能影响蛋白的溶解性和稳定性，可能会影响蛋白从凝胶转移到膜上的效率或者影响蛋白在膜上的保留。可以在下表中一窥潜在影响：

 

表1：各种翻译后修饰对蛋白溶解性与稳定性的影响及其机理

 

● 以下我们将结合具体蛋白举一些实例：

 

1.  ENOS蛋白经过肉豆蔻酰化、棕榈酰化或磷酸化等修饰后，实际检测分子量增大，会出现条带大小增大和多带现象。

 

2.  Nrf2蛋白存在多种翻译后修饰（如乙酰化、糖基化、磷酸化和泛素化），导致实际检测分子量大小在100kD左右，远大于其预测大小68kD。此外，由于该蛋白易被降解，样本处理时加入抑制蛋白酶体的药物如MG132可以获得更多信号。同时，其检测结果可能出现多带现象，主要由多种修饰形式和降解产物造成。

 

3.  CD31蛋白因其存在多个糖基化修饰位点和磷酸化修饰，导致实际检测时条带大小可达125kD，比预测大小大四十多个kD。因此，在检测这类蛋白时要避免膜的移动，保留全部膜，完整观察膜上的所有条带，以准确确定蛋白定位；还应另外设置阳性对照组。

 

4.  Mannose receptor蛋白由于糖基化修饰导致实际检测分子量大小变为200kD左右，而非预测的166kD，反映其蛋白质结构的复杂性；且作为多次跨膜蛋白，样品制备时不应煮样，避免蛋白聚集，产生影响蛋白迁移的非特异性结合或聚合物，进而导致检测困难或信号弱。

 

5.  如COX 2蛋白的相关实验表明，糖基化修饰也可能造成条带模糊不清的现象；CD63蛋白具有多糖基化修饰的特点，导致实际检测到的条带大小范围极其广泛，很可能检测到的条带全都出现弥散现象；PD-L1等存在糖基化修饰的肿瘤相关蛋白，在检测时也可能出现条带弥散的现象；这一现象究其根本原因，在于多重糖基化修饰位点的活动不会完全一致，因此带来多种不同的修饰后蛋白，导致其实际分子量形成一个连贯谱系，表现在条带上则是广泛弥散的条带。

 

6.  大量的翻译后修饰导致蛋白存在多种形式，表现在电泳结果中即是多个条带。如骨桥蛋白Osteopontin由于存在糖基化、磷酸化等多种翻译后修饰，在实际实验中可能检测到多条蛋白条带，且大小与预测值32kD严重不符；内源性c-Myc蛋白在发育后可能经历修饰，导致其出现多带条带，甚至可能有时实验结果无信号。

 

7.  多次跨膜蛋白在高温下易发生聚集，如果在制备样品时煮样，可能导致后期检测无信号；抗体的免疫原序列为CXCRF的C端序列如同时存在磷酸化形式，也可能会干扰抗体与蛋白的结合，导致无信号现象；还有可能是由于蛋白的后修饰导致其分子量变大，实际检测的条带位于55或60kD以上，但所使用的抗体识别的范围却只覆盖到50kD以下，因此出现无信号的结果。

来源：实验老司机

关键词： WB实验